Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
сахара обозначены буквами, которые соответствуют связывающим участкам
фермента, идентифицированным методом рентгеноструктурного анализа.
Механизм действия ферментов
433
Рис. 7.10. Предполагаемый механизм действия лизоцима.
рактере окружения остатков позволяют полагать, что в активном ферменте,
оптимум pH которого лежит в области 5-8, Glu-35 находится в
неионизированном, a Asp-52 - в ионизированном состоянии.
Механизм действия лизоцима, предложенный Верноном [4894], схематически
представлен на рис. 7.10. Протонированная карбоксильная группа Glu-35
действует как общий кислотный катализатор, поставляя протон кислороду
гликозидной связи. Это приводит к образованию интермедиата, являющегося
по химической природе карбониевым ионом, стабилизируемым ионизированной
карбоксильной группой Asp-52. Последующие превращения этого интермедиата
являются по существу обращением первой стадии, при этом место первого
продукта (ROH) занимает молекула воды.
Данные о важности двух рассматриваемых карбоксильных групп для
каталитического процесса получены при исследовании pH-зависимости
активности фермента |[3711]; опыты с использованием необратимого
ингибитора - триэтоксонийфторбората, который реагирует только с
ионизированными карбоксильными группами, - позволили установить, что р/(
Asp-52 и Glu-35 равны 4,5 и 5,9 соответственно i[3612]. Показано, что
восстановление
454
Глава 7
А
сн2он
Б
СН2ОН
(NAG)jO \ОИ
о
н
(NAG)3(
О
NH
NH
с=о
с=о
Рис. 7.11. А. Предполагаемая структура переходного состояния для реакции,
катализируемой лизоцимом. Б. Аналог переходного состояния.
карбоксильной группы Asp-52 до спиртовой с образованием остатка
гомосерина приводит к полной потере активности i[1282]; дополнительные
аргументы в пользу важности карбоксильных групп для каталитического
процесса были получены при модификации другими химическими реагентами
[2822]. Участие в каталитическом процессе карбониевого иона в качестве
интермедиата подтверждается результатами определения изотопных эффектов
[946, 4353], а также данными о том, что аналог переходного состояния,
представленный на рис. 7.11, связывается •с ферментом более прочно, чем
(NAG) 4 )[4177].
Менее бесспорным в рассматриваемом механизме действия лизоцима является
предположение о напряжении в кольце четвертого остатка сахара (кольцо D,
рис. 7.9). Основываясь на данных, полученных с помощью молекулярных
моделей, Блейк :и др. [437, 439, 440] сделали вывод, что это кольцо,
находясь в нормальной конформации кресла, не может хорошо вписаться в
область связывающего участка, если же кольцо примет напряженную
конформацию полукресла, то будет достигнуто достаточно точное
соответствие (рис. 7.12). Поскольку считали, что интермедиат -
карбониевый ион - находится в конформации полукресла, было высказано
предположение, согласно которому субстрат принимает конформацию
переходного состояния вследствие напряжения, возникающего при связывании
его с ферментом; это приводит к увеличению эффективности процесса
катализа. То обстоятельство, что (NAG)3 является очень плохим субстратом
лизоцима, в рамках предложенной модели можно было объяснить тем, что
взаимодействие остатка сахара с участком связывания D-кольца на ферменте
энергетически невыгодно ¦и связывание (NAG)3 в области каталитического
центра оказывается крайне маловероятным. Исследования по связыванию
аналога переходного состояния (рис. 7.11) также можно было
интерпретировать в рамках данной модели |[4177]. Однако ре-
Механизм действия ферментов
455.
2'в 4н, 4н,
Рис. 7.12. Некоторые возможние конформации кольца глюкозы. Показаны
конформации кресла (С), лодки (В), полукресла (Н) и софы. Углеродные
атомы-кольца пронумерованы в соответствии с общепринятыми правилами: в
положении 1 находится редуцирующая группа. Атом кислорода в кольце
занимает "нулевое" положение. В заштрихованной плоскости находятся четыре
углеродных атома кольца. Атомы, лежащие над плоскостью кольца, указаны
индексами вверху слева от буквы, а лежащие под плоскостью кольца -
индексами
внизу справа.
зультаты рентгеноструктурных исследований комплекса лизоци-ма с этим
аналогом свидетельствуют о том, что аналог принимает конформацию софы
,[1396], а не истинную конформацию полукресла. Детальные расчеты
энергетики процесса связывания субстрата с ферментом привели Левитта
([2777] к выводу, что при связывании с ферментом остаток D не изменяет
конформацию и что если бы это и происходило, то выигрыш энергии оказался
бы небольшим. Он предполагает, что неблагоприятный энергетический баланс
при связывании кольца D может быть обусловлен вытеснением двух молекул
воды, локализованных около Asp-52.
Значительно меньше известно о механизме действия других гликозидных
гидролаз. Для функционирования а-амилаз необходим ион Си2+ ,[1406, 4869],
однако неясно, участвует ли он в катализе или же в поддержании надлежащей
конформации фермента. При действии р-амилаз происходит обращение
