Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
Хотя третичная структура пепсина и сходного с ним пеницил-лопепсина
определена методом рентгеноструктурного анализа (с низким разрешением)
[120, 4558], механизм действия этого фермента остается в значительной
мере невыясненным. Пепсин А (КФ 3.4.23.1) имеет оптимум pH между 2 и 3;
результаты исследования влияния на активность фермента ;[887, 1055] в
совокупности с данными по влиянию химической модификации [[327, 1044,
1812, 2896] показали, что существенными для катализа являются две
карбоксильные группы остатков Asp-32 и Asp-215; при этом в активной форме
фермента Asp-32 находится в ионизированном, a Asp-215 - в
неионизированном состоянии. Данные химической модификации указывают также
на вероятное участие в каталитическом процессе остатка тирозина ,[1922,
2798, 3680].
Пепсин катализирует ряд реакций транспептидации; так, при инкубации
фермента с М-ацетил-Ь-тирозил-Ь-тирозином образуются N-ацетил-Ь-тирозин и
Ы-ацетил-Ь-тирозил-Ь-тирозил-Ь-ти-розин [3403] в соответствии с реакцией
Acetyl.Туг.Туг4- Acetyl.Туг.Туг
ч -A cetyl. Туг + Acetyl. Туг. Туг. Туг. (7.59)
Постулируют., что в ходе этой реакции в качестве интермедиата образуется
аминофермент, в котором аминогруппа переносимого фрагмента субстрата
ацилирована ферментом. Предположение об образовании такого
аминоферментного интермедиата получило дополнительную аргументацию, когда
было показано, что аминокислота-акцептор конкурирует с водой за
интермедиат в соответствии с реакцией [135, 4743]
RjCooh^E-OH + r3cor2 e-oh + r,co-nhr2^ r,cooh + e-nhr2 (7.60)
HjO^E-OH + ^NRj
и с помощью радиоактивного карбобензокси-Ь-тирозил-Ь-тирози-на
зафиксировано образование интермедиата и установлено, что в нем нет
эфирной группировки [53].
Поскольку фермент катализирует обмен 180 между водой и ацилированной
аминокислотой, например N-ацетил-Ь-фенилала-нином [2574, 4220] ([см.
уравнение (7.54)], было высказано предположение об образовании в ходе
реакции ацилферментного интермедиата. Еще одним аргументом в пользу этого
является обнаружение при гидролизе Ь-лейцил-Е-тирозил-Ь-лейцина в
качестве одного из продуктов реакции L-лейцил-Ь-лейцина, который может
образоваться только в результате реакции ацильного
Механизм действия ферментов
451
переноса [3412, 4640, 4983]: Е-ОН + Leu. Туг. Leu ч=
Leu.Tyr.Leu Leu.СО.О-Е ------------------>
+
Туг. Leu
Leu.Leu.Туг.Leu+Е-ОН. (7.61) |н,о Leu. Leu + Туг. Leu
Таким образом, можно предполагать, что один фрагмент субстрата при
связывании с ферментом образует аминофермент, а другой - ацилфермент.
Возможный механизм действия пепсина, предложенный Бевдером и Кежди [353],
представлен на рис. 7.8;
А,
о
он
1Ь"н2о
//°
с
/ \ V
о
\
о
CHR.
I
с=о
I
NH
\^1
CHR О I
//
С
/ V . \
с-NH - CHR
/>
Е о + NH.CHR-
\ /
С
/
\
С - <^> - С - CHR-¦
С -NH-CHR %
Рис. 7.8. Предполагаемый механизм действия пепсина.
452
Глава 7
в нем учтены рассмотренные выше данные. Согласно этому механизму, две
карбоксильные группы фермента, взаимодействуя, образуют ангидрид; при
реакции последнего с субстратом образуются ацилфермент и аминофермент;
при этом ацилфермент является смешанным ангидридом, который может
спонтанно гидролизоваться, освобождая карбоксильную группу; последняя
атакует аминофермент, что приводит к освобождению второго продукта и
регенерации ангидрида на ферменте. В настоящее время, однако,
предлагаемый механизм нельзя рассматривать как твердо установленный.
ЛИЗОЦИМ
Из числа ферментов, которые гидролизуют гликозидные связи, наиболее полно
был изучен лизоцим; третичная структура фермента из яичного белка была
установлена методом рентгеноструктурного анализа (см. гл. 10). Природными
субстратами этого фермента являются полисахариды клеточной стенки
бактерий, однако фермент гидролизует также 1,4-(3-И-ацетилглю-
козаминилолигосахариды, расщепляя гликозидную связь между четвертым и
пятым остатками сахара с нередуцирующего конца, как показано на рис. 7.9.
Рентгеноструктурные данные, обсуждающиеся в гл. 10, показывают, что
активный центр образует глубокую щель на поверхности фермента, и вдоль
этой щели связывается субстрат. Исследования на молекулярных моделях с
целью экстраполяции данных, полученных при изучении структуры комплекса,
образуемого ферментом с тримером (1,4-р-Й-ацетилглюкозамин)з, (NAG)3,
позволили локализовать участки связывания индивидуальных остатков
сахаров, входящих в состав более длинных олигосахаридов; было показано
также, что единственными аминокислотными остатками, расположенными
достаточно близко к гидролизуемой связи, являются остаток глутамата (Glu-
35) и остаток аспартата (Asp-52) i[437, 439, 440]. Оказалось, что остаток
глутамата находится в неполярном, а остаток аспартата - в полярном
окружении на разных сторонах щели. Данные о ха-
А В С D . F F
NHCOCHj NHCOCH3 NHCOCH, NHCOCH, NII'OCH, NHCOCH,
Рис. 7.9. Синтетический субстрат лизоцима, гекса-1,4-(3-1У-
ацетилглюкозамин [(NAG)6]. Стрелка показывает место расщепления. Остатки
