Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
-С N N . н-О
//
шГ\^ /0^0- " к'
О *н -.о-с R
ь
1
102
AspA-с N N-т-Н О
о-^с R
1
Asp2|
102
Vh^ r,
h
о-
/ /-er495 С N . N Ну Ацилферменщ
LI
О' н
R'
-О С R
Н>°^| I
^*R ОН
, /' ~У='\ М"'
йК^ ЛчЛ. КТ
О " Н о С-R
I h 1
/ Ч~^=^ ^
Asp\_c N N-Н . О
102Г \ v\^ М
О-Н u r,_C_R
Ser-195
Н
1
h
O'.
A 5 / 7^ ^er'195
AspA-(f N N н-О
mJ\ _ / N/'
° H H"°~j-R
Рис. 7.5. Предполагаемый механизм действия химотрипсина с участием
системы с переносом заряда.
смотря на большие различия в специфичности этих ферментов {4265, 4544].
Структурные исследования показывают, что у трипсина, тромбина и эластазы
расположение остатков, участвующих в предполагаемой системе с переносом
заряда, сходно. Подобная система, по-видимому, имеется и у бактериальной
про-
446
Глава 7
теиназы субтилизина, хотя этот фермент по структуре (аминокислотная
последовательность, пространственная структура) значительно отличается от
химотрипсина [2587].
Механизм действия холинэстераз изучен менее полно, однако во многих
отношениях действие этих ферментов и сериновых протеиназ сходно.
Исследования с использованием DFP показали, что в катализе участвует
остаток серина и в процессе реакции, вероятно, образуется ацилферментный
интермедиат. Кроме того, характер влияния pH на скорость реакции сходен с
тем, который наблюдается у химотрипсина, хотя кинетические исследования
действия холинэстеразы (КФ 3.1.1.8) осложнены тем, что графики двойных
обратных величин оказываются нелинейными [187]. Как отмечено выше,
механизм действия этих ферментов и сериновых протеиназ, вероятно, сходен,
однако Крупка [2612] предложил несколько иной механизм, в котором наряду
с активным серином участвуют два остатка гистидина.
Активность ряда протеиназ, нечувствительных к ингибированию DFP, по-
видимому, связана с высокореакционноспособной сульфгидрильной группой. К
числу этих ферментов относятся растительные протеиназы - папаин (КФ
3.4.22.2) и фицин (КФ 3.4.22.3). Третичная структура папаина установлена
методом рентгеноструктурного анализа (см. гл. 10). Эти ферменты содержат
в молекуле один остаток цистеина, который обладает необычно высокой
реакционной способностью по отношению к ртутьсодержащим соединениям и
алкилирующим агентам {1342, 2455]. Лоув [2873] отметил, что
последовательность аминокислот, включающая указанный остаток цистеина в
фицине и папаине, сходна с последовательностью, включающей
реакционноспособный остаток серина в трипсине; это позволяет высказать
предположение, что протеиназы данного класса произошли в процессе
эволюции от общего предшественника.
Путь катализируемой папаином реакции, по-видимому, сходен с таковым для
химотрипсина, но в случае папаина в качестве ковалентного интермедиата
образуется тиоацилфермент. Данные об образовании такого интермедиата
получены спектроскопическими ][588, 2687, 2875] и кинетическими методами.
Поскольку максимальные скорости гидролиза папаином ряда эфиров гиппуровой
кислоты одинаковы [2876], можно полагать, что на пути гидролиза этих
эфиров имеется одна и та же лимитирующая стадия, однако этой стадией не
обязательно является распад ацилферментного интермедиата. Подобные
результаты были получены и при изучении гидролиза ряда эфиров N-ю-
карбобен-зокси-Ь-лизина [588]. N-гранс-циннамоилимидазол, соединение,
которое, как было показано, быстро реагирует с Ser-195 в химо-трипсине,
подобным же образом реагирует с цистеином (Cys-25) в папаине [588]. Был
выделен N-грамс-циннамоилпапаин и изучена кинетика его деацилирования
[588].
Механизм действия ферментов
447
?-SH + RGONH* =*==* Е-SH • RCONH2 ч=±
сг
I н2°
ъ=± Е-S-С-NH2 ч=*= Е-SCOR =*=* ESH + RCOOH. R
Рис. 7.6. Путь реакции, катализируемой папаином; в ходе реакции
образуется тетраэдрический интермедиат в результате атаки активированного
цистеина на карбонильную группу амидного субстрата. Предполагается, что в
рассматриваемом процессе цротон тиоловой группы переходит на соседний
гистидин, подобно тому, как это происходит при функционировании
химотрипсина (см.
рис. 7.5).
Наличие остатка гистидина (His-158) вблизи активного цистеина было
установлено в результате рентгеноструктурных исследований (см. гл. 10), а
также на основании экспериментов, которые показали, что этот гистидин
можно химически связать ¦с Cys-25 с помощью бифункционального реагента
1,3-дибромацетона [2098]. В результате исследований влияния pH на
активность фермента сделан вывод, что рЯ этого гистидина равно примерно
4; это обусловлено, по-видимому, тем, что он частично находится в
гидрофобном окружении, создаваемом молекулой фермента [1153]. Остаток
His-158 может играть роль общего основного катализатора, активируя
цистеин путем частичного оттягивания от него протона [1326, 1481]. Однако
система с переносом заряда, в которую входит карбоксильная группа, в
папаине не обнаружена, поскольку ближайший остаток аспарагиновой кислоты
локализован слишком далеко от остатка гистидина, чтобы играть роль общего
