Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
проиллюстрировать различные типы наблюдаемых для них химических
механизмов.
ЭСТЕРАЗЫ И ПРОТЕИНАЗЫ,
В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ КОТОРЫХ УЧАСТВУЮТ АКТИВНЫЕ ОСТАТКИ СЕРИНА И ЦИСТЕИНА
Было показано, что ряд гидролаз чрезвычайно чувствителен к ингибированию
диизопропилфторфоофатом (DFP) и некоторыми родственными
фосфорорганическими соединениями (рис. 7.2); в каждом случае при
гидролизе ингибированного фермента было установлено, что ингибитор
реагирует с одним и-тем же остатком серина в молекуле фермента |[811,
1799, 1800, 3537]; определение последовательности аминокислот показало,,
что остатки, соседние с серином, сходны у ряда ферментов млекопитающих
(см. табл. 7.5).
Указанные ферменты значительно различаются по специфичности, однако всем
им присуща общая черта - они способны-катализировать гидролиз эфиров;
было высказано предположение, что эти ферменты произошли от общей
исходной эстеразы,. t при этом эволюционные изменения привели к различиям
в специфичности ферментов, но мало затронули химический механизмз
Л-
Механизм действия ферментов
441
Таблица 7.5
Аминокислотные последовательности, включающие активный остаток серина,
для некоторых эстераз и протеиназ [1017]
Фермент
Последовательность
Химотрипсин А (КФ 3.4.21.1)
Трипсин (КФ 3.4.21.4) Эластаза (КФ 3.4.21.11) Тромбин (КФ 3.4.21.5)
Ацетилхолинэстераза (КФ 3.1.1.7) Холинэстераза (КФ 3.1.1.8)
Карбоксилэстераза (печень быка) (КФ 3.1.1.1)
Субтилизин (В. sub-tilis) (КФ 3.4.21.14)
Cys Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val
Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu His
Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val
Glu Ser Ala
Phe Gly Glu Ser Ala Gly (Ala Ala Ser)
Gly Glu Ser Ala Gly Ala Glu Ser
Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
катализируемой реакции '[1799, 3904, 4973]. Поскольку в каждом из
ферментов DFP реагирует только с одним остатком серина и поскольку
свободный и находящийся в составе пептидов серии не реагирует с заметной
скоростью с DFP, было высказано предположение, что этот уникальный
остаток серина каким-то образом активирован. Эта активация обусловлена,
вероятно, особенностями трехмерной структуры рассматриваемых ферментов,
поскольку ни химотрипсиноген, ни денатурированный мочевиной трипсин не
реагируют с фосфорорганическими ингибиторами )[ 1791 ]. Хотя имеются
данные о том, что остаток серина в рассматриваемых эстеразах активирован,
можно полагать, что главным фактором, определяющим его высокую
реакционную способность по отношению к DFP, является сходство последнего
с эфирными субстратами, позволяющее ему специфически связываться с
ферментом и действовать как "ингибитор, направленный на активный центр"
(см. гл. 8); локальная концентрация ингибитора в области серинового
остатка оказывается очень высокой в результате образования первоначально
нековалентного фермент-ингибиторного комплекса [2947, 3222].
Ингибирование рассматриваемых ферментов под действием DFP еще не является
доказательством того, что специфический остаток серина непосредственно
участвует в катализе, поскольку присоединение объемистой
диизопропилфосфорильной группы к остатку в области, близкой к активному
центру, может привести
4-14
442
Глава 7
А ты п-Толуоп-
CH,OSO;
NaOH
СН
-NH-CH-CO-
> -NH-C-CO-
-NH-CH-CO-
CH2OPMS
Тиоацетат
-NH-CH-CO- > -NH-CH-CO-
CfySCOCH,
CHjSH
Рис. 7.3. Химическая модификация остатков серина в ферментах. А.
Превращение Ser-195 в химотрипсине в остаток дегидроаланина [4546]. Б.
Превращение Ser-220 в субтилизине в остаток цистеина [3384].
к ингибированию в результате блокирования доступа субстрата к активному
центру фермента. В случае химотрипсина, однако, показано, что превращение
этого остатка серина (Ser-195) химическим путем в остаток дегидроаланина
(рис. 7.3, А) приводит к полной инактивации фермента без нарушения
связывания субстрата или обратимого ингибитора ,[4546]. Подобные
результаты были получены с субтилизином, у которого остаток серина был
химическим путем трансформирован в остаток цистеина [3384]
Более прямые данные о роли этого остатка были получены при исследовании
катализируемого химотрипсином гидролиза л-нитрофенилацетата (см. гл. 4).
Установлено, что ацетилфер-ментный интермедиат, образующийся в этой
реакции {см. уравнение (4.303)], является стабильным в области низких pH
[268]; после кислотного гидролиза было показано, что ацетильная группа
связана с остатком активного серина. Эти результаты позволяют считать,
что каталитическая реакция осуществляется путем нуклеофильной атаки на
карбонильную группу субстрата с образованием ацетил фермента, который
затем гидролизуется водой. л-Нитрофенилацетат является, однако, очень
плохим и неспецифическим субстратом химотрипсина, поэтому необходимо было
показать, что и специфические субстраты гидролизуются по механизму,
включающему стадию образования ацилфермен-та, как это отражено в
уравнении (7.53) для гидролиза эфирного субстрата:
