Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
ту часть молекулы субстрата, которая не переносится ферментом. Подобный
эксперимент можно провести и с продуктом реакции; если добавить к
ферменту ВХ и В* в отсутствие А, то фермент будет катализировать
изотопный обмен В. Если же ввести в систему X*, то ни в одном из случаев
не будет происходить изотопного обмена.
Этот метод весьма эффективен при исследовании реакций, которые протекают
с промежуточным переносом группы на фермент, и в последнее время он все
шире входит в употребление,
434
Глава 7
Ниже мы приведем несколько случаев, в которых с помощью этого метода
удалось достаточно полно раскрыть механизм реакции.
Сахарозофосфорилаза (КФ 2.4.1.7) катализирует реакцию a-G-1-Ph + F= a-G-
1-F + Ph, (7.31)
где Ph - фосфат, G - глюкоза, F - фруктоза, a-G-1-F - сахароза. Реакция
представляет собой, следовательно, обратимый перенос остатка глюкозы от
фосфата на фруктозу. Если добавлен только глюкозофосфат (либо вместе со
свободным фосфатом, либо без него), то, очевидно, никакой химической
реакции протекать не должно, так как в отсутствие фруктозы нет акцептора
для фосфата. Однако было обнаружено [1144], что в среде, содержащей
Нз32Р04 и глюкозофосфат, фермент катализирует быструю реакцию изотопного
обмена
a-G-l-Ph + Ph* =a-G-l-Ph* + Ph. (7.32)
Это указывает, что фермент соединяется с остатком глюкозы, освобождая
фосфат; изотопный обмен в таком случае осуществляется следующим
образом:
G-1-Ph + E = G-1-E + Ph, (7.33)
G-l-E + Ph* =G-1-Ph* + E. (7.34)
Позднее это было подтверждено путем использования, фруктозы, меченной 14С
(обозначим ее через F*) i[5142J. В отсутствие фосфата фермент
катализирует обмен
a-G-1-F + F* = a-G-F* + F, (7.35)
который возможен только в том случае, если фермент образует
соединение с остатком глюкозы, т. е. именно с той частью молекулы, по
отношению к которой он специфичен и которую он переносит на другие
молекулы. Данный фермент, следовательно, не является истинной
фосфорилазой, так как фосфат не обязательно участвует в реакции. Фермент
может переносить остатки глюкозы на разные другие молекулы, и это
обстоятельство дает дальнейшее подтверждение правильности указанного
гипотетического механизма. Другие доказательства промежуточного переноса
остатка глюкозы на фермент приведены на с. 431-432.
Если обратиться к мальтозофосфорилазе (КФ 2.4.1.8), то положение окажется
совершенно иным. Катализируемая реакция может быть изображена в этом
случае следующим образом:
ct-G-G + Ph = P-G-l-Ph + G. (7.36)
То обстоятельство, что в результате реакции происходит оптическая
инверсия, является указанием на прямой перенос, а не на перенос с
образованием промежуточного соединения (комплекса с ферментом). В
соответствии с этим рассматриваемый
Механизм действия ферментов
435
фермент не катализирует изотопный обмен ни по реакции [1358]
P-G-1-Ph + Ph* = P-G-1-Ph* + Ph, (7,37)
ни (в отсутствие фосфата) по реакции
oc-G-G + G* = a-G-G* -f G. (7.38)
В присутствии фосфата катализируется реакция (7.38), но это объясняется
просто обратимостью реакции (7.36).
Таким образом, имеющиеся данные показывают, что в этом случае соединение
фермент - глюкоза не образуется и транс-гликозилирование осуществляется
путем прямого переноса остатка глюкозы от одного субстрата к другому в
соответствии с уравнением (7.27). Гликогенфосфорилаза (КФ 2.4.1.1) также
не способна катализировать реакцию изотопного обмена (7.32) [834].
Эти результаты согласуются с поведением ферментов в присутствии арсената.
В опытах с сахарозофосфорилазой добавление арсената вызывает быстрый
гидролиз сахарозы с образованием свободной глюкозы и фруктозы и гидролиз
глюкозо-1-фосфата с образованием свободной глюкозы и фосфата. Причина
этого заключается в том, что арсенат может участвовать в реакции вместо
фосфата, образуя крайне нестабильный глюкозо-арсенат, который спонтанно
распадается с большой скоростью. Следовательно, после реакций (7.39) и
(7.40) будут идти реакции (7.41) и (7.42):
G-l-F + Е = G-1-E + F, (7.39)
G-l-Ph -f- Е = G-l-E-f- Ph, (7.40)
G-1-E + As = G- 1-As + Е, (7.41)
G-l-As -)- Н20 = G 4* As> (7.42)
где As - это H3ASO4.
С другой стороны, мальтозофосфорилаза, которая не образует промежуточного
соединения фермент-глюкоза, не способна катализировать гидролиз |3-
глюкозо-1-фосфата в присутствии арсената, и это согласуется с ее
неспособностью катализировать реакцию (7.37). Однако, как и следовало
ожидать, этот фермент катализирует гидролиз мальтозы в присутствии
арсената, так как данный процесс может осуществляться в результате
прямого переноса остатка глюкозы на арсенат
a-G-G -f As = P-G-l-As + G, (7.43)
после чего следует реакция (7.42). Приведенные результаты убедительно
подтверждают различие в механизме действия двух указанных ферментов,
которое было установлено методом изотопного обмена.
436
Глава 7
Подобным образом были исследованы и некоторые другие ферменты. СоА-
трансфераза 3-кетокислот (КФ 2.8.3.5) катализирует реакцию обмена {2901 ]
