Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
белков с помощью чистых пептидаз, а не сильных кислот. Пептидазы в
отличие от сильных кислот обладают специфичностью и расщепляют
определенные пептидные связи (гл. 6), поэтому молекулы ферментов
гидролизуются не до аминокислот, а до пептидных фрагментов различной
длины; эти фрагменты могут быть выделены и проанализированы. Поскольку
при действии разных пептидаэ образуются пептиды с перекрывающимися
последовательностями аминокислот, можно расположить фрагменты в том
порядке, в котором они находятся в исследуемом' ферменте, хотя этот
процесс является очень трудоемким. Естественно, чтобы начать, анализ,
надо иметь чистый фермент.
Первым белком, полную аминокислотную последовательность которого
определил Сэнгер [4065], был инсулин, низкомолекулярный белок, не
обладающий ферментативной активностью. В 1963 г. была установлена
аминокислотная последовательность еще двух ферментов - рибонуклеазы
[4362] и лизо-цима [669] (оба этих фермента также имеют небольшую
молекулярную массу--ниже, чем средняя молекулярная масса большинства
ферментов), а в следующем году Хартли [1797] опубликовал данные о
последовательности аминокислот у более типичного фермента, а-
химотрипсина, молекула которого приблизительно в 5 раз больше молекулы
инсулина. С тех пор число ферментов с известной аминокислотной
последовательностью стало быстро увеличиваться (см. [1017] и [430]).
Второе важнейшее достижение было связано с применением
рентгеноструктурных методов высокого разрешения для выяснения деталей
трехмерной структуры кристаллических ферментов. Эти методы, впервые
использованные Перутцем и Кендрью примерно в 1961 г. для анализа двух
белков, не являющихся ферментами, миоглобина и гемоглобина, затем были
успешно-
734
Глава 10
применены для изучения десятков ферментов; они способствовали выяснению
их природы и механизма действия. Первым ферментом, структура которого
была полностью установлена, явился лизоцим [438, 440]; как уже
упоминалось, это относительно низкомолекулярный фермент. Объем, работы,
необходимый для определения структуры ферментов средних размеров, очень
велик, и она была бы практически неосуществима без использования мощных
ЭВМ. Тем не менее к 1970 г. удалось определить структуру нескольких
ферментов (все они являются гидролизами), а именно: а-химотрипсина [415],
эластазы .[4264], карбоксипептидазы А [2841] и субтилизина [74] (см.
также [3679]).
Следует подчеркнуть, что для определения полной структуры фермента
необходимо провести оба типа исследований. Знание аминокислотной
последовательности само по себе недостаточно для того, чтобы установить
взаимное расположение разных частей цепи и их групп в пространстве.
Действительно, внутримолекулярная геометрия фермента определяется
характером укладки длинной полипептидной цепи, приводящим к формированию
структуры, близкой по форме к глобуле, а характер укладки в свою очередь
определяется последовательностью химических групп вдоль цепи; но при
теперешнем уровне наших знаний едва ли возможно предсказать детали
укладки цепи, зная только аминокислотную последовательность, и еще меньше
шансов предсказать форму образующегося каталитического центра. С другой
стороны, для того чтобы расшифровывать карты электронных плотностей,
получаемые с помощью рентгеноструктурного анализа, необходимо знать
аминокислотную последовательность. Таким образом, оба указанных метода
дополняют друг друга.
Следует также отметить, что в настоящее время лишь немногие ферменты
могут быть изучены этими методами, поскольку подавляющую часть ферментов
пока не удалось получить в кристаллическом виде, а большинство из числа
закристаллизованных ферментов образуют слишком мелкие кристаллы, которые
непригодны для исследования методом рентгенострук-ного анализа. Весьма
желательно иметь в кристаллическом виде и производные фермента,
содержащие атомы тяжелых металлов, с тем чтобы можно было использовать
метод изоморфного замещения, который значительно облегчает интерпретацию
полученных данных. Нет сомнений, что техника выращивания крупных
кристаллов ферментов будет со временем совершенствоваться, но в настоящее
время структуру большинства ферментов нельзя исследовать этими методами,
и мы вынуждены довольствоваться информацией, которую можно получить,
пользуясь старыми методами, рассмотренными выше.
Структура ферментов
73S
СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ
Различают четыре уровня структурной организации молекулы белка, в том
числе и фермента. Под первичной структурой белка понимают
последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной
цепи. Пептидная цепь, однако, не может находиться в растянутом (линейном)
состоянии - исследования показывают, что молекулы ферментов имеют
приблизительно глобулярную форму, т. е. цепь должна быть-свернута в
спираль или определенным образом уложена. Под вторичной структурой
понимают характер укладки белковой цепи, например в спираль
(преимущественно а-спираль), в которой следующие друг за другом витки
