Витамины - Девятин В.А.
Скачать (прямая ссылка):
Примечание. Для получения препарата фосфатазы можно поступать следующим образом: хлебные дрожжи растирают с тремя весовыми частями ацетона, по прошествии 30 мин. массу отфильтровывают, осадок на фильтре промывают 3—4 раза ацетоном и высушивают на фильтровальной бумаге. Высушенный осадок промывают 3—5 раз порциями по 50 мл Vio' N раствором фосфата натрия (на 1 г осадка—50 мл раствора), каждый раз суспендируя осадок, растирая его с раствором и центрифугируя. Промытый осадок суспендируют в 0,lAf растворе фосфата (pH 3,7), к смеси добавляют некоторое количество толуола и хранят препарат на холодильнике (сохраняет свою активность 2—3 недели)-
Определение в растительных и животных продуктах (овощи, фрукты, консервы, свежая и сухая зелень, мясные изделия и т. д.),
по Мурри
]) Процедура
Навеску тонко измельченного (растертого в ступке, размолотого на мельнице или в мясорубке) материала, содержащего от 10 до 25 y аневрина, помещают в колбочку с обратным воздушным холодильником, прибавляют 40—80 мл 1 %-ной НС1, тщательно перемешивают, нагревают до кипения и кипятят 1 —2 мин. По охлаждении приводят к желаемому объему (50—100 мл) и часть экстракта отфильтровывают.
В три мерных цилиндра с притертыми пробками на 20—25 мл (или в капельные воронки) наливают по 1—5 мл экстракта и по 2 мл метилового спирта. Узнают, сколько требуется окислителя для полного окисления аневрина: для этого в J-й и 2-й цилиндры прибавляют по 1 мл 30%-ного раствора NaOH и перемешивают. В 1-й цилиндр прибавляют микропипеткой по каплям, при перемешивании, 1 %-ный раствор красной кровяной соли до тех пор, пока окраска раствора не станет несколько желтее, чем во 2-м цилиндре (избыточная желтая окраска не должна исчезать в течение полминуты). Замечают объём прибавленного в J-й цилиндр раствора. В цилиндр 2-й (контрольный опыт) прибавляют 12 мл изобутилового спирта, энергично встряхивают в течение 1 мин. и содержимое переносят в центрифужную пробирку. В 3-й цилиндр прибавляют то количество раствора красной кровяной соли, которое оказалось достаточным в 1-м цилиндре, и сейчас же добавляют 1 мл 30%-ного NaOH, тщательно перемешивают и оставляют стоять на 7а—] мин. После этого добавляют 12 мл изобутилового спирта, энергично встряхивают в течение 1 мин. и выливают в центрифужную пробирку.
Растворы II и III центрифугируют до полного отделения спиртового слоя, собирают спиртовой слой в те же цилиндры, промывают встряхиванием с 4 мл воды, переносят в центрифужные пробирки и вновь центрифугируют. Спиртовой слой вновь переносят в цилиндры, доводят до 15 мл изобутиловым спиртом и сушат фильтрованием через обработанную бутанолом сухую гигроскопическую вату.
Примечание. Часто растительные вытяжки, несмотря на указанную обработку, остаются окрашенными, что мешает установлению количества раствора красной кровяной соли, потребной для окисления всего аневрина. В таком случае нужно брать ряд одинаковых объемов испытуемого раствора (не менее трех) и обрабатывать, как указано для 3-го раствора, но с прибавлением разного количества окислителя (0,1; 0,5; 1 мл) и из них отобрать для определения флуоресценции наиболее интенсивно флуоресцирующую пробу.
2) Приготовление стандартного раствора
Приготовляют водный раствор кристаллического аневрина, содержащий точно 1 или 2 у витамина в 1 мл. Этот раствор устойчив при хранении на холоду и в темноте в течение ] мес.
К 1 мл исходного раствора добавляют 2 мл метанола и, при перемешивании, 0,05—0,] мл J %-ного раствора K3Fe(CN)6 и 1 мл 30 %-ного раствора NaOH. Оставляют в покое в течение 1 мин., затем встряхивают с 12 мл изобутилового спирта в течение 1—2 мин., выливают в центрифужную пробирку и заканчивают процедуру, как указано выше. Содержание аневрина в 1 мл этого раствора вычисляют путем деления количества микрограммов взятого аневрина в растворе на 15 (объём полученного спиртового раствора). Этот раствор наливают в микробюретку.
3) Флуорометрирование
Две пробирки (одна из них содержит точно 5—10 мл контроль* ного опыта, другая—такое же количество испытуемого раствора) освещают ультрафиолетовыми лучами перед черным светофильтром ртутно-кварцевой лампы. В пробирку с холостым опытом прибавляют из микробюретки по каплям стандартный окисленный раствор аневрина до тех пор, пока флуоресценция в обеих пробирках не уравняется. В пробирку с испытуемым раствором приливают такое же количество чистого изобутилового спирта (для уравнивания объёмов).
Расчет содержания аневрина в испытуемом растворе производится весьма просто, так как при равенстве объёмов прибавленного из микробюретки стандартного окисленного раствора аневрина к холостому опыту содержание аневрина будет равно тому количеству его, которое содержится в объеме испытуемого раствора, взятого для флуорометрирования.
Примечание. В случае, если в холостом опыте оказывается много посторонних флуоресцирующих веществ, раствор нужно предварительно проэк-страгировать бутанолом (1—3 раза). Обработанный таким образом раствор практически не должен показывать флуоресценции.
