Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
III. Сбор фага................................................. 60
Методика 3. Быстрый метод получения трансдуцирующего фага Р22 62
Методика 4. Очистка фага
................................................. 63
I. Ступенчатые градиенты CsCl для ротора Beckman 50.1 64
II. Равновесный градиент для ротора SW 50.1................. 64
Методика 5. Транспозиция элемента Тп
10................................... 66
I. Получение дефектного трансдуцирующего фага из штамма NK 337 66
174
Содержание
II. Добавление отростков к головкам фага Р22................... 67
III. Транспозиция при траисдукции ............................. 69
Методика 6. Отбор мутантов Tets среди штаммов, несущих элемент
Тп 10 70
Методика 7. Выявление фага к с функционирующим геном р-лактама-
зы на чашках Red............................................... 71
Методика 8. Индукция мутаций гидроксиламином.............................
73
I. Выделение мутаций в фаге или клонированном гене (например, в гене р-
лактамазы)............................ * . 73
II. Локализованный мутагенез (по котраисдукции) ... 73
Методика 9. Отбор делеционных мутантов фага к ...........................
75
Методика 10. Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo 77
I. Стандартное скрещивание (для определения частоты рекомбинации или Для
создания рекомбинанта) ...... 77
II. Комплемеитационный тест по размножению фага ... jg
III. Спот-тест на комплементацию мутантов фага (к или
Р22) 78
Методика И. Выделение ДНК из фага к......................................
82
I. Формамидный метод........................................... 82
II. Быстрый метод выделения ДНК фага к......................... 84
III. Выделение ДНК из термоиндуцибельиых лизогеиов 5аш7
.......................................................... 86
IV. Разделение цепей ДНК фага к................................ 87
Методика 12. Выделение плазмидной и бактериальной ДНК ... - 88
I. Выделение больших количеств плазмидной ДНК из Е. coli 88
II. А. Быстрый метод выделения плазмидной и (или) бактериальной ДНК из
колоний или жидких культур .... 90
II. Б. Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из 10 мл жидкой культуры
............................................... 93
Методика 13. Удаление бромистого этидия из ДНК, находящейся в
растворе CsCl ............................................... 94
Экстракция изопропанолом или бутанолом......................... 94
Методика 14. Образование гибридных фагов A,gt............................
95
I. Расщепление ДНК............................................. 95
II. Ковалентное соединение с помощью ДНК-лигазы фага Т4 96
Методика 15. Упаковка ДНК фага к в вирусные частицы in vitro . . 97
I. Упаковка ................................................... 97
II. Получение индуцированных упаковывающих клеток . . 98
Методика 16. Трансфекция ДНК фага к .....................................
99
I. Выращивание клеток ........................................ 99
II. Приготовление клеток ...................................... 99
III. Заражение клеток ДНК..................................... 100
IV. Хранение клеток......................................... 100
Методика 17. Субклонирование фрагментов ДНК в векторах-плазмидах Е.
coli........................................................... 101
Методка 18. Трансформация плазмидной ДНК................................
102
Методика 19. Способность гибридного фага к комплементации в клег- -
ках Е. coli................................................... 104
I. Литическнй отбор из пула гибридов Е. coli ...... 104
II. Отбор из пула гибридов по двойным лизогенам . . * 105
Методика 20. Электрофорез в агарозном геле .............................
108
Содержание
175
I. Агарозный гель ......................................... 108
II. Окрашивание ДНК в агарозных гелях.................... 111
III. Фотографирование гелей, содержащих нуклеиновые кислоты
...................................................... 112
IV. Гели с глиоксалем.................................... 113
Методика 21. Перенос ДНК на нитроцеллюлозу или диазотированиую
бумагу ...................................................... 115
I. Перенос нз агарозных гелей ............................... 115
II. Перенос из бляшек фага Я* ........... 117
III. Перенос из бактериальных колоний.................... 120
Методика 22. Внесение метки а-32Р в ДНК с помощью ник-трзнсляции 121
I. Реакция .................................................. 121
II. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
(dNTP)............................................ 122
III. ДНКаза ................................................. 122
IV. Проверка включения 32Р в ДНК......................... 123
V. Выделение меченой ДНК................................. 123
VI. Общие замечания...................................... 124
Методика 23. Гибридизация с иммобилизованной ДНК или РНК на
твердом носителе ............................................ 125
