Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
(ауксотрофности), а экспрессия встроенной генетической информации - к
лекарственной устойчивости. Оба этих фенотипа обусловлены одной и той же
вставкой и при последующих генетических манипуляциях оказываются
полностью сцепленными (Юескпег et al., 1975).
Такие вставки и ауксотрофность представляют большую ценность для самых
разнообразных генетических манипуляций с бактериями (Kleckner et al.,
1977). Например, с их помощью можно избирательно ввести в интересующий
нас штамм любой определенный маркер ауксотрофности. Для этого мутацию от
донора со вставкой, вызвавшей ауксотрофность (например, от штамма
hisG9436 : : ТпЮ, инсерционного мутанта TetRHis~), вводят в реципиент.
Проводят отбор на наследование лекарственной устойчивости (положительный
отбор). Каждый рекомбинант, получивший устойчивость (в результате обычной
рекомбинации), обязательно должен приобрести и ауксотрофность донора.
(Транспозиция происходит настолько редко по сравнению с рекомбинацией,
что не'вызывает осложнений.) Описано много примеров использования таких
ауксотрофов со вставками (Kleckner et al., 1977; Chumley et al., 1979;
Chumley and Roth, 1980; Schmid and Roth, 1980).
Заслуживает внимания то, каким образом возникают такие мутанты со
вставками (инсерционные мутанты), так как они появляются с высокой
частотой, хотя уровень мутагенеза, которому подвергаются клетки,
оказывается чрезвычайно низким. Каждый из выделенных мутантов возникает в
результате одного и только одного мутационного акта. По этой причине не
происходит выделения мутантов с множественными повреждениями и таким
образом обходится затруднение, возникающее при интенсивной химическом
мутагенезе.
20
Раздел I. Эксперименты
Обоснование и план эксперимента
В этом эксперименте транспозон Тп 10 (сообщающий устойчивость к
тетрациклину) вводится в клетки Salmonella с помощью специально
сконструированного фага Р22 (Chan et al., 1972; Kleckner et al., 1975).
Такой фаг содержит Tn 10, а также несет мутации, блокирующие репликацию
фага (12~), лизис (13~), репрессию (c2ts) и интеграцию (int~). Эти
мутации фага препятствуют передаче донором реципиенту устойчивости к
тетрациклину (TetR) любым обычным способом (т. е. посредством
лизогенизирования или образования плазмиды). Поскольку в фаговой ДНК нет
участков, гомологичных хромосоме реципиента, то наследование элемента ТпЮ
в результате обычной гомологичной рекомбинации также происходить не
может. При таких условиях проводится отбор клеток, устойчивых к
тетрациклину. Реципиент должен приобрести элемент Тп10 в результате
необычной, незаконной рекомбинации, т. е. в результате, транспозиции его
из хромосомы фага Р22 в хромосому реципиента. Каждая колония
трансдуктантагТеР* представляет собой результат одного независимого акта
транспозиции, и каждый транс-дуктант содержит одну копию ДНК транспозона
Тп 10 в каком-то своем сайте хромосомы. При используемых условиях такие
трансдуктанты TetR возникают с частотой 1 на 105 зараженных клеток.
В, реальном эксперименте мутант Р22 Тс 10, т. е. множественный мутант
фага Р22, несущий в своем геноме Тп 10 (Chanetal., 1972), смешивают с
клетками и высевают на чашки с богатой средой, содержащей тетрациклин.
Образовывать колонии способны лишь те клетки реципиента, которые получили
Тп 10 (путем транспозиции). После того как эти колонии вырастут, их
перепечатывают на чашки с богатой средой [LB (бульон Лу-риа - Бертани) +
тетрациклин] и на чашки с минимальной средой (Е + тетрациклин).
Ауксотрофы выявляют, сравнивая эти чашки-реплики. Используемый в таком
скрещивании фаг получают индукцией лизогенного штамма NK337, как это
описано в методике 5. Там же описано, как определять титр этого
дефектного фага.
Методика
Транспозиция Тп10
1. Смешайте фаг Р22 (лизат клетки NK337) и клетки Salmonella дикого
типа (штамм LT2) в таком соотношении, чтобы множественность заражения
была меньше единицы. Инкубируйте, чтобы провести адсорбцию фага. Вылейте
смесь на чашки со средой LB+тетрациклин (20 мкг/мл)+ЭГТА
1. Выделение вставок Тп 10, приводящих к ауксотрофности
21
(10 j4M). Высевайте столько клеток, чтобы получить около 100-200 колоний
в расчете на одну чашку (см. методику 5). Приготовьте 15 таких чашек на
одну группу. Инкубируйте чашки при 40°С до тех пор, пока не появятся
колонии (около 24-36 ч).
Выявление ауксотрофов
2. Каждую трансдукционную чашку перепечатайте на чашку LB +тетрациклин
(20 мкг/'мл)+ЭГТА и на чашку Е + тетра-циклин (10 мкг/мл). Инкубируйте
при 37°С.
3. Сравните чашки-реплики с богатой средой и с минимальной средой. Выявив
колонию, выросшую на богатой среде, но от-' сутствующую на чашке с
минимальной средой, отберите ее уколом с чашки с богатой средой и
рассейте штрихом до отдельных колоний на чашке Green + тетрациклин (без
ЭГТА). Такие чашки с рассевом инкубируйте при 37°С.
Классификация ауксотрофов
4. Со штриха каждого потенциального ауксотрофа отберите уколом
слабоокрашенную (чувствительную к фагу) колонию. По шаблону перенесите
