Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
Двухцепочечная ДНК или РНКА26о=1 для раствора 50 мкг/мл Одноцепочечная
ДНК или РНК А2ео= 1,3 для раствора 50 мкг/мл Плотность двухцепочечной
ДНК- =( [молярное содержание G + С] +14,19) /8,63^ 1,7 г/мл Плотность
РНК=1,9 г/мл Плотность фага 1,5 г/мл
Растворы белков
А28о=1,Одля раствора с концентрацией 1 мг/мл ДНК-лигаза фага Т4 А^'% =1,0
ДНК-полимераза Е. coli А^0/" =0,85
Если имеется примесь нуклеиновой кислоты, то концентрация белка в
растворе (в мг/мл) равна 1,5 A2so-0,75 А2во
Приложение 5
Подготовка трубок для диализа
1. Отрежьте кусок трубки нужной длины (10-20 см).
2. Прокипятите в буфере NaHC03:
154
Раздел III. Приложения
339 г безводной соды на 1 л воды 14 г №2-ЭДТА на 1 л воды.
3. Промойте внутреннюю часть трубки дистиллированной водой.
4. Прокипятите в 10~3 М 1Ча3-ЭДТА.
5. Храните при 5°С.
6. Перед использованием трубки промойте ее внутри дистиллированной водой.
7. Всегда работайте с трубкой только в перчатках.
Приложение 6
Измерение объемов, единицы
I. Измерение микролитровых объемов
А. Автоматические пипетки Gilson (Р20 и Р200)
Пипеткой Р20 можно отбирать от 1 до 20 мкл, а пипеткой Р200 - от 20 до
200 мкл. В наконечнике этих пипеток имеется большой мертвый объем
воздуха. Если температура жидкости, в которую погружают наконечник,
отличается от температуры воздуха, то объем воздуха в наконечнике
изменится, и это приведет к ошибке в объеме отбираемой жидкости. Всегда
медленно возвращайте поршень в верхнее положение. Не допускайте, чтобы
поршень резко отскочил вверх. Чтобы в наконечник набрался полный объем
жидкости, подождите 1-2 с.
Б. Микрошприцы
1. Hamilton 710-SN на 100 мкл, диаметр 6 мм, размер канала 20, игла со
скошенным концом.
2. Hamilton 705-SN на 50 мкл, диаметр 6 мм, размер канала 20, игла со
скошенным концом.
3. Glenco 19 909-10-2X26 на 10 мкл, диаметр 6 мм, размер канала 26, игла
со скошенным концом.
4. Hamilton 7101N на 1 мкл.
К шприцам на 100 и на 50 мкл можно присоединить тонкостенный
полиэтиленовый или тефлоновый шланг с внутренним диаметром 0,034 дюйма
(~0,086 см). Обычно для этого используют трубки Intermedic РЕ 90 (Clay
Adams). К шприцам на
6. Измерение объемов, единицы
155
10 мкл и на 1 мкл можно присоединить тонкостенную трубочку из полиэтилена
или тефлона с внутренним диаметром 0,015 дюйма (~0,038 см). Обычно
используют трубки Intermedic РЕ 20 (Clay Adams). Шприцом на 1 мкл
пользуются в основном для того, чтобы отбирать небольшие количества
ферментных препаратов. При этом 0,1 мкл отбирается обычно с точностью
±20%.
Микрошприцы обладают меньшим мертвым воздушным объемом, чем
автоматические пипетки, и потому характеризуются, как правило, большей
точностью. Следует периодически очищать металлический поршень в шприцах
на 100, 50 и 10 мкл (но не в шприце на 1 мкл). Для этого выньте поршень.
Сполосните корпус шприца и поршень ацетоном, а затем водой. Если поршень
сильно загрязнен, то он может застрять и (или) поцарапать корпус шприца.
Обычно в канале корпуса шприца имеются тонкие царапины, которые видны по
преломлению света. Из-за них в шприц может подтекать воздух, что приводит
к неточности в измерении объема. Если из-за сильного износа вдоль поршня
подтекает воздух, то смажьте канал корпуса шприца и поршень небольшим
количеством глицерина.
II. Температура плавления ДНК
1. Влияние нуклеотидного состава и соли
Тпл= 16,6 lg(Na+) + 0,41%(G + C) + 8l,5, (уравнение 1)
Для ДНК фага ХЬ2 содержание G + С = 51 %,
7ПЛ= 85,8°С при 0,1 М NaCl,
7ПЛ= 97,4°С при 0,5 М NaCl.
2. Влияние формамида
1 % формамида понижает Тпп на 0,65°С.
3. Значение гомологии в ДНК
Каждый процент негомологичности последовательности ДНК понижает Гпл на
1,5°С.
4. Влияние длины ДНК
Уменьшение длины двухцепочечной молекулы ДНК приводит к снижению
температуры плавления. Температура плавления коротких ДНК вычисляется
следующим образом:
Тп" короткого дуплекса = ТПЛ длинного дуплекса (уравне-
Число пар оснований в коротком дуплексе
III. Время осветления
Ротор JA-21, 18X10 мл Ротор JA-20 , 8X 50 мл Ротор JS-I3,
4X50 мл Ротор JA-14, 6X 250 мл Ротор JA-10, 6 x 500 мл
Ротор JS-7,5, 4X250 мл
Тыс. об/мин С Тыс. об/мин с Тыс. об/мин С Тыс. об/мии с Тыс.
об/мин с Тыс. об/мин с
2 580 2 770 2 800 2 820 2 900 2 1200
4 140 4 190 4 200 4 200 3 400 3 520
5 92 5 120 5 130 5 130 4 230 4 290
6 64 6 86 6 90 6 90 5 140 5 190
8 36 8 48 8 50 8 51 6 100 6 130
10 23 10 31 10 32 10 32 7 74 7 95
12 16 12 21 11 26 11 27 8 56 7,5 83
14 12 14 16 12 22 12 22 9 45
16 9 16 12 13 19 13 19 10 36
18 7 18 9 14 17
20 6 20 8
21
Для центрифуги Eppendorf 3200 (12 000 об/мин) для пробирок на 1,5 мл С =
8,0,
для пробирок на 0,5 мл С = 7,6,
Время осветления в часах = 100 C/s, где s - коэффициент седиментации, а
С= К/100.
Ротор JA-21 примерно соответствует ротору SE-12, ротор JA-20 - ротору SS-
34, ротор JA-14-тору НВ-4, ротор JA-10 - ротору GS-3 и ротор JS-7,5-
ротору HS-4.
In
К =
Rn
10"
3600
2,5 • 10* In
