Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
г V R S R р F L Y S Т S F Y
S V F L Y F Y Y
альфа- и бета-цепей продуктов I-А и I-Е ряда гаплотипов. Эти данные были получены микросеквенированием с использованием антигенов, меченных радиоактивным атомом в процессе биосинтеза.
В то время как анализ последовательности приносит подробную информацию о небольшом участке молекулы, сравнение карт триптических пептидов
дает общее, хотя и менее детальное представление о всей молекуле. Картирование триптических пептидов эффективно в тех случаях, когда нужно определить, являются ли изучаемые молекулы идентичными, похожими или очень различными, но этот метод не дает информации о точных структурных взаимосвязях. Разные пептиды могут элюироваться вместе и появляться в виде одного пика, но, как правило, результаты, полученные этим методом, могут привести к преувеличенным представлениям о различиях между молекулами. Различие между пептидами даже по одной аминокислоте может привести к различию в характере элюции при использовании техники ионообменной или обратнофазной хроматографии.
Как отмечалось ранее, при анализе триптических пептидов мутантных молекул Н-2КЬ методом ионообменной хроматографии были успешно идентифицированы пептиды, различавшиеся всего лишь по одному аминокислотному остатку. Выявляемые свойства триптических пептидов зависят от того, какие радиоактивно меченные аминокислоты были использованы в работе. Поскольку трипсин расщепляет пептидную депь с карбоксильной стороны большинства остатков Arg и Lys, мечение этими радиоактивными аминокислотами дает возможность выявить все пептиды, кроме С-концевого. Другие радиоактивные аминокислоты были использованы индивидуально или в смеси для получения пептидных карт. Такой анализ особенно эффективен для решения вопроса о том, идентичны ли исследуемые цепи.
Исходя из данных по секвенированию N-концевых участков и сравнения пептидных карт молекул класса II, можно сделать ряд выводов. Между аллельными продуктами наблюдается больше сходства, чем между цепями А0, Ар, Еа и Ер, закодированными в одном и том же гаплотипе. Сравнение цепей Еа положительных гаплотипов I-Е выявило мало различий. Отмечена идентичность по 16 из 26 доступных для сравнения N-концевых аминокислот, кроме того, при сравнении триптических пептидов наблюдалось 93% совпадений. При сравнении цепей Аа или Ар разных гаплотипов было обнаружено лишь около 50—65% совпадений пептидов, причем цепи Ар характеризуются большей вариабельностью. Отсутствие очевидной гомологии в первичной структуре компонентов альфа- и бета-цепей указывает на то, что каждая цепь кодируется отдельным геном.
Плодотворное исследование выраженного полиморфизма антигенов класса II осуществили Джонс и др. [46, 47], использовавшие метод двумерного электрофореза в геле, разработанный О'Фарреллом [52]. Согласно этому методу, молекулы разделяют в одном направлении в зависимости от заряда с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ) или электрофореза в неравновесном градиенте pH (ЭНГрН), а затем проводят разделение молекул по размерам во втором (перпендикулярном) направлении, используя ДСН-ЭПАГ. Для изучения антигенов 1а обычно используют препараты радиоактивно меченного антигена и результаты двумерного электрофореза регистрируют с помощью радиоавтографии или флюорографии в зависимости от использованного изотопа.
При ИЭФ молекулы мигрируют, пока не достигают положения в стабильном градиенте pH, в котором они уже не имеют заряда; в определенных условиях статическое положение в градиенте pH будет совпадать с изоэлектрической точкой молекулы. Альфа-цепи молекул I-А и I-Е имеют сравнительно кислый характер, и их можно разделить с помощью ИЭФ. Бета-цепи более щелочные, для их разделения используют ЭНГрН, в основе ЭНГрН лежат те же принципы, что и в основе ИЭФ, с той лишь разницей, что при ЭНГрН не устанавливается стабильный градиент pH.
Г
На радиоавтографе, полученном после двумерного разделения антигенов класса II выявляется множество бета-пятен, как видно на примере разделения ; молекул I-Е (рис. 14.10), схематическое изображение полученного результата > представлено на рис. 14.11. Такой сложный характер распределения может быть связан с посттрансляционными модификациями, влияющими на подвижность молекул, например, дезамидированием остатков глутамина или аспарагина ; или различием в содержании сиаловых кислот в углеводных цепях. Характер распределения несколько упрощается, если использовать экстракты клеток,
~ ?1(М
I
ВЮА
О
i
ф'
«ж-
*.vy
1-Ак
I3
/-?*
Рис. 14.11. Схема распределения преципитата I-Ek в двумерном электрофорезе в геле, изображенном на рис. 14.10. Стрелками указано направление, соответствующее увеличению модификаций полипептидной цепи. (По [46].)
