Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
результатами определения N-концевых последовательностей, когда вновь | не удалось найти черты, уникальные для продуктов К или D (см. табл. 14.3), I Тем не менее анализ всех накопившихся к настоящему моменту данных показывает, что третий домен антигенов класса I мыши может иметь «маркерные»1 последовательности, характеризующие их как продукты разных областей (рис. 14.7). Новые данные сделали возможным проводить анализ вариаций антигенов класса I по методу оценки вариабельности By — Кэбата [78]. Диаграмма вариабельности трех внеклеточных доменов молекул класса I показывает, что наиболее консервативен третий домен. Вариации сконцентрированы на сравнительно малом числе участков, между которыми расположены протяженные крайне консервативные области (рис. 14.8).
14.2.6.3. Организация экзонов и интронов класса I
Как уже отмечалось, библиотеки кДНК создают путем обратной транскрипции с мРНК. Следовательно, клоны кДНК могут содержать информацию лишь об участках, кодирующих реально существующие белки, и представлять лишь s
Рис. 14.9. Структура экзонов и интронов Последовательность гена сопоставляется с |
геномного клона, кодирующего молекулу последовательностью белка II-2KA ([41]; f
Н-2 класса I. печатается с разрешения.) {
i
те гены, которые транскрибируются с последующим процессингом образую- 5 щейся РНК. Существует, однако, и второй тип библиотек ДНК, полученных | путем расщепления общей клеточной ДНК рестриктирующими ферментами I и «упаковки» фрагментов ДНК в бактериофаг. Когда эти так называемые «геном- ? ные» библиотеки, полученные из различных клеточных линий и тканей мыши,! подвергли скринингу, используя зонды ДНК генов класса I, появилась воз-1 можность локализовать и изучать гены МНС в той форме, в какой они реально | существуют в геноме. I
Был осуществлен полный анализ последовательности ДНК ряда геномных клонов класса I комплекса Н-2. Оказалось, что, как и другие изученныеI гены, эти гены содержат кодирующие последовательности (экзоны), между! которыми встроены некодирующие последовательности (интроны). Удивитель- г ная особенность геномной организации экзонов класса I состоит в том, что их | организация почти непосредственно отражает подразделение на домены, выяв-1 ляемое при анализе белковой структуры. На рис. 14.9 организация гена класса 11 сопоставляется с белковой структурой молекулы Н-2КЬ. Отметим, что первый! экзон кодирует гидрофобную N-концевую «лидерную» последовательность. |
Второй, третий и четвертый экзоны кодируют внеклеточные домены; размеры этих экзонов приблизительно совпадают с величинами, получаемыми при анализе распределения белка на домены на основе последовательности аминокислот. Четвертый экзон включает трансмембранный участок, а также С-кон-цевой участок, содержащий много основных аминокислот. Цитоплазматическая часть молекулы кодируется несколькими небольшими экзонами; в этой области были установлены вариации в длине разных генов.
Гены HLA класса I человека имеют аналогичную организацию. Единственное различие заключается в том, что участок гена, кодирующий С-концевую цитоплазматическую часть молекулы, состоит лишь из двух экзонов и общая длина образующейся белковой молекулы на 10 аминокислотных остатков меньше, чем длина Н-2КЬ мыши.
14.2.6.4. Реэкспрессия генов класса I
\
Как уже отмечалось, трудно обнаружить корреляцию между последовательностями ДНК молекул класса I и серологически выявляемыми продуктами, если нет прямых данных о первичной структуре соответствующих белков. Существует, однако, экспериментальный подход, позволяющий обойти эту трудность, если создать специальный геномный клон. Такой клон, несущий ген класса I в сочетании с генетической информацией, позволяющей клетке выжить в условиях дефицита какого-либо метаболита (т.е. в селективной среде), встраивают в геном новой клетки-хозяина. Некоторые из трансформированных таким путем клеток экспрессируют не только продукт, необходимый для роста на селективной среде, но и продукт одновременно внесенного клонированного гена класса I. После этого трансформированные клетки можно типировать стандартными серологическими методами, проводить сравнительный структурный анализ нового продукта с известными белками и таким образом идентифицировать ген. Этот экспериментальный подход был успешно использован при анализе гена H-2Ld, экспрессию которого удалось осуществить в L-клетках.
14.2.6.5. Число генов класса I
С помощью метода, получившего название блоттинг по Саузерну, можно оценить число генов данного генома, гомологичных конкретному генному зонду. Метод заключается в том, что геномную ДНК расщепляют рестриктирующими ферментами (рестриктазами) и разделяют фрагменты методом одномерного электрофореза. Затем производят блоттинг, т.е. перенос фрагментов ДНК из геля на полоску ацетатцеллюлозы, которая впитывает ДНК вместе с содержащейся в геле жидкостью. При этом ДНК фиксируется на полоске. Затем полоску инкубируют в растворе, содержащем радиоактивный зонд. По окончании инкубации ее многократно промывают и проводят радиоавтографию. На полученном в результате отпечатке будут избирательно выявляться лишь те фрагменты ДНК, которые гомологичны радиоактивному зонду. В случае антигенов класса I известно, что большинство членов соответствующего мультигенного семейства имеет высокую степень гомологии. Поэтому при использовании достаточно длинного зонда ДНК оценка числа генов класса I представляется вполне достоверной.
