Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
1 Рецептор IL-2 человека представляет собой трансмембранный белок, состоящий из 251 аминокислотного остатка (см. обзор [96]). Рецептор отличается высоким содержанием углеводов (около 40% массы молекулы). В геноме человека имеется лишь одна копия структурного гена рецептора IL-2, локализованная на хромосоме 10. Имеется две группы рецепторов IL-2: высокоаффинные и низкоаффинные. Лишь первые являются функциональн» значимыми для Т-клеточной пролиферации. Высокоаффинный рецептор имеет дополнительную субъединицу — белок с молекулярной массой 70000-77000 дальтон [97]. Рецепторы IL-2 есть не только на Т-, но и на активированных В-лимфоцитах [98]. Активированные В-лимфоциты способны пролиферировать in vitro под действием гомогенного рекомбинантного IL-2. Рецепторы IL-2 обнаружены также на эмбриональных тимоцитах [99]. Значительной гомологией (более 60%) с рецептором IL-2 человека обладает его мышиный аналог — белок, состоящий из 247 аминокислотных остатков [100]. — Прим. перев.
Обратная величина от разведения образца
Рис. 21.3. Определение биологической активности IL-2.
Клетки CLTT-2 (клон 15Н; 4 • 103 клеток на лунку) инкубировали в течение 25 ч в объеме 0,2 мл с двухкратными разведениями образцов, содержащих IL-2, а затем еще 4 ч в присутствии 3H-Tdr. А. Зависимость уровня включения 3H-Tdr от разведения образца IL-2. И для стандарта (темные кружки), и для опытного образца (светлые кружки) зависимость ответа от логарифма концентрации IL-2 описывается сигмоидной кривой. Б. Пробит-анализ данных, приведенных на рис. А. На этом графике значимыми считаются только те точки, которые попадают в границы двух стандартных отклонений от среднего значения включения 3H-Tdr. За титр принимается обратная величина от разведения образца, вызывающего включение 3H-Tdr на уровне 50% от максимального. Поэтому титр стандартного образца (темные кружки) равен 16, а опытного образца (светлые кружки) — 93. Стандартному образцу условно приписывают активность 1,0 ед/мл. Для определения активности опытного образца его титр делят на титр стандарта (т. е. 93 : 16 = 5,6 ед./мл).
116]. При сравнении с описанными в предыдущем разделе единицами IL-1 абсолютные значения активности IL-2 окажутся в 100 раз меньше, так как для вычисления активности образца IL-2 в единицах на 1 мл необходимо обратную величину титра делить на 10, а не умножать на 10, как в случае IL-1. Некоторые исследователи стали рассчитывать число условных единиц IL-2, умножая обратную величину разведения на десять [41]. Поэтому встречающиеся в настоящее время в литературе единицы активности IL-2 могут различаться в 100 раз. Очевидно, что проблема могла бы быть решена введением международного стандарта, как это было сделано в других областях.
Первые биохимические исследования IL-2 мыши и человека, в которых использовалась кондиционированная среда от нормальных клеток, показали, что при гель-фильтрации биологическая активность элюируется одним пиком. Однако, как и IL-1, IL-2 оказался гетерогенным по заряду: при изоэлектрофокусировании IL-2 обнаруживался в различных фракциях [43]. Хотя гетерогенность по заряду могла быть обусловлена посттрансляционными модификациями или деградацией полипептидной цепи, нельзя было исключить и такой возможности, что митоз Т-клеток вызывается несколькими разными полипептидами. Тем не менее в отличие от ситуации с IL-1 детальное исследование различающихся по заряду форм IL-2 человека показало, что причина заключается в неодинаковой степени сиалирования и гликозилирования молекул [44]. При отщеплении нейраминидазой от IL-2 человека концевых, отрицательно заряженных остатков сиаловых кислот или при биосинтезе IL-2 в присутствии ингибиторов гликозилирования наблюдалось смещение изоэлектрической точки в сторону более щелочных значений pi (р! = 8,2) и образование только одного
биологически активного продукта. Кроме того, при характеристике тем же методом заряда IL-2, полученного от лейкемических клеток Jurkat, оказалось, что почти вся активность фокусировалась в одном пике с той же самой изоэлек-трической точкой (pi = 8,2).
Электрофоретический анализ в присутствии додецилсульфата натрия показывает, что IL-2, продуцируемый нормальными лимфоцитами миндалин или клетками линии Jurkat, гомогенен по размеру. В невосстанавливающих условиях молекулярная масса биологически активного продукта составляет 14 500 дальтон. Таким образом, человеческий IL-2 гомогенен по размеру и заряду, причем эти молекулярные характеристики идентичны для IL-2, продуцируемого нормальными лимфоцитами и трансформированной Т-клеточной линией. Несмотря на то что эти данные выглядят обнадеживающими, все же не следует считать доказанным, что за биологическую активность, пршшсыва-мую IL-2, отвечает лишь один полипептид. Возможно, для IL-2 характерна микрогетерогенность, прежде всего по остаткам нейтральных аминокислот, которую не удалось обнаружить методами гель-фильтрации, изоэлектрофокусирования и электрофореза в полиакриламидном геле.
0 наличии микрогетерогенности свидетельствуют, в частности, иммуно-химические данные. Одно из моноклональных антител (IgG2a, обозначенные DMS-3), полученных недавно к IL-2 линии клеток Jurkat, связывает только 50 % биологической активности IL-2, присутствующей в кондиционированной среде клеток Jurkat (К. A. Smith, неопубликованные данные). Поэтому, хотя почти весь IL-2, продуцируемый клетками Jurkat, при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия мигрирует в виде одной полосы и гомогенен по результатам изоэлектрофокусирования, все же вполне возможно, что имеется не один полипептид, обладающий биологической активностью IL-2. Подобные результаты говорят о том, что на данном этапе исследований следует проявлять большую осторожность, приписывая биологическую активность IL-2 единственному полипептиду. 1
