Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
Проведенные недавно исследования показали, что во взаимодействии IL-2 с активированной Т-клеткой участвует мембранная молекула, обладающая свой-
ствами, характерными для рецептора полипептидных гормонов, а именно: высокой аффинностью, присутствием лишь на клетке-мишени и специфичностью к гормону [39]. Вычисленная по результатам равновесного диализа, а также по кинетике связывания биосинтетически меченного IL-2 человека целыми клетками или выделенными плазматическими мембранами константа диссоциации оказалась равной 5-10-12 М [40] (рис. 21.2). Связывание радиоактивно меченного IL-2 характеризуется кривой насыщения, причем уровень неспецифической сорбции не превышает 3—4 %. В соответствии с тем, что IL-2 вызывает
(Клетки)
(Мембраны)
Связанный, молекул/клетках Ю'5
Рис. 21.2. Связывание радиоактивно меченного IL-2 с целыми клетками и выделенными плазматическими мембранами. Биосинтетически меченный 3Н-лейцином и 3Н-лизином фактор роста Т-клеток получен стимуляцией клона 6.2 клеток Jurkat фитогемагглютинином и форболмиристатацета-том. IL-2 был выделен из супернатанта иммуноаффинной хроматографией на моноклональных антителах (DMS-3) к IL-2. А. Связывание со стимулированными фитогемагглютинином лимфоцитами перифериче-
Связэнный, молекул/игхКГ3
ской крови человека в отсутствие (темные кружки) и присутствии (светлые кружки) 100-кратного избытка немеченого IL-2. Б. Связывание с плазматическими мембранами, выделенными из клеток HUT-102B2. В. График Скэтчарда, построенный по данным опыта А после учета ненасыщаемого связывания. Г. График Скэтчарда, построенный по данным опыта Б после учета ненасыщаемого связывания. ([40]. Печатается с разрешения.)
митоз лишь активированных антигеном или лектином Т-лимфоцитов, центры связывания IL-2 обнаруживаются только на Т-клетках, стимулированных антигеном (или лектином). Радиоактивно меченный IL-2 не связывается с В-клетками (неактивированными и ЛПС-активированными В-клетками, трансформированными В-клеточными линиями): этот факт весьма существен для решения вопроса, действует ли IL-2 не только на Т-, но и на В-лимфоциты? Ввиду того что большинство экспериментов, где изучалось действие IL-2 на В-клетки, проводилось с теми концентрациями IL-2, в которых наблюдаются связывание его Т-клетками и Т-клеточная пролиферация, отсутствие заметного высокоаффин-
ного связывания радиоактивно меченного IL-2 В-клетками убедительно свидетельствует о том, что В-лимфоциты не являются мишенями IL-2.
Количество меченого IL-2, связывающегося с цельными клетками, и количество IL-2, вызывающего пролиферацию Т-лимфоцитов, практически идентичны. Тесная корреляция констант диссоциации, измеренных по равновесному связыванию IL-2 с интактными клетками или очищенными плазматическими мембранами, с константами, определенными по кинетике связывания IL-2 с плазматическими мембранами, показывает, что взаимодействие IL-2 с рецептором подчиняется физико-химическим закономерностям, характерным для взаимодействий лиганд—полимер. Следовательно, идентичность кривых, характеризующих связывание и биологический эффект, говорит о том, что в физиологических условиях переменными величинами, определяющими уровень биологического ответа, являются концентрация IL-2, число молекул рецептора и его аффинность1.
21.1.3.2. Биохимическая характеристика
Биохимическое изучение IL-2 в существенной степени облегчалось наличием описанного выше теста, позволяющего проводить быстрый количественный анализ активных фракций [16] (рис. 21.3). По сравнению с другими методами, применяемыми в клеточной иммунологии, в которых используются свежевыделенные мононуклеарные клетки, использование клонированных линий Независимых лимфоцитов позволило уменьшить затраты времени на обнаружение биологической активности с 3—7 дней до 24 ч. Однако, как и в случае интерферона, IL-1 и других лимфокинов, для изучения биохимических свойств требовался подходящий источник IL-2. Активность IL-2, продуцируемого стимулированными лектином нормальными мононуклеарными клетками, составляла 50 % от максимальной при титре лишь 1 : 10. Введение в качестве костимуля-тора форболмиристатацетата (ФМА) несколько увеличивало выход IL-2; таким способом удавалось повысить титр в 4—5 раз. Однако решающую роль для дальнейших биохимических исследований сыграло то, что были обнаружены мышиные [41] и человеческие [42] раковые Т-клеточные линии, стимуляция которых давала супернатанты с титром от 1 : 500 до 1 : 1000. На практике увеличение титра в 100 раз означало, что 1 л кондиционной среды от раковых клеток был эквивалентен 100 л среды от нормальных клеток. Таким образом, впервые появилась возможность получения IL-2 в количествах, необходимых для выделения активного начала.
Следует отметить, что не все исследователи использовали для количественной оценки активности IL-2 одни и те же единицы. Первоначально величину «одна единица на 1 мл» приписали количеству IL-2, содержащемуся в образце, активность которого при разведении 1 : 10 составляет 50 % от максимальной
