Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
Ультрогель АсА54 53 528 5 283 6 49040 6
Изоэлектрофокусирование 4 1650 16 500 0,064 1037,000 2
сированию (ИЭФ). Тридцать процентов активности терялось при осаждении сульфатом аммония, однако оно было необходимо для уменьшения объема супернатанта до такого, с которым можно работать на следующей стадии разделения. Значительные потери IL-1 имели место и в процессе гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе: после этой стадии сохранялось лишь 12% первоначальной активности. Если пересчитать на объем исходного супернатанта, то окажется, что на этой стадии исследователи имели дело только с эквивалентом 574 мл IL-1-содержащей среды, и хотя активность повышалась более чем в 1000 раз (от 920 до 108 000 ед/мл) из-за большого количества белка (49 мг), удельная активность возросла лишь в три раза (от 3490 до 10 930 ед./мг). В результате двух следующих стадий очистки (а именно хроматографии на ультро-геле и ИЭФ) активность снизилась еще в 8 раз. В итоге после удаления большей части посторонних белков была достигнута 300-кратйая очистка IL-1 (с 3 490 до 1 037 000 ед./мг). Однако из-за больших потерь биологической активности из четырех литров исходного супернатанта был получен образец объемом 4 мл, содержащий очень незначительное количество биологически активного IL-1: титр препарата по сравнению с исходным возрос всего в 18 раз, а именно от 1 : 92 до 1 : 650.
Описанный эксперимент демонстрирует характерные трудности, с которыми приходится сталкиваться при попытке препаративного выделения лимфокинов из кондиционированной среды, содержащей сыворотку. Единственным методом, пригодным для уменьшения объема препарата, является осаждение сульфатом аммония, поскольку присутствие сыворотки препятствует концентрированию с помощью ультрафильтрации или вакуумного диализа. Действительно, 70-кратное концентрирование фильтрованием (эквивалент концентрирования, полученного при осаждении сульфатом аммония) дало раствор, содержащий 70% сыворотки плода коровы (СПК) (47,8 мл СПК в 69 мл раствора). При описанной схеме выделения после первой стадии очистки сохраняется лишь 12% первоначальной активности. Низкий выход IL-1 сильно затрудняет его выделение в количествах, достаточных для изучения биологических функций, что в свою очередь препятствует исследованию механизма действия IL-1. И вновь следует вспомнить опыт работы с интерфероном. Препаративное выделение IL-1 могло бы стать несравненно проще, если бы, используя не содержащую сыворотку среду, удалось достичь увеличения исходной активности хотя бы в 100— 1000 раз.
Секретируемый клетками P388DX мышиный IL-1, изученный наиболее полно, обладает следующими свойствами: по данным гель-фильтрации и электрофореза в полиакриламидном геле это белок с кажущейся массой от 12 до
16 к Да, чувствительный к действию протеиназ. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле препарата, частично очищенного по схеме, приведенной в табл. 21.1, выявил наличие четырех различных окрашиваемых пятен в области 14 кДа, различающихся по изоэлектрическим точкам. По-видимому, только три из них обладают активностью IL-1, поскольку с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере удается выделить лишь три белка, различающихся по заряду и вызывающих пролиферацию ти-моцитов[33] Ч
1 Строение IL-1 человека было определено по структуре соответствующего гена [85]. Имеется по крайней мере два типа IL-1, существенно различающихся по аминокислотной последовательности: кислый (р! 5.0) IL-la и нейтральный (pi 7.0) IL-ip. Оба типа IL-1 синтезируются в виде крупных белков-предшественников, состоящих соответственно из 271 и 269 аминокислотных остатков. Зрелый внеклеточный IL-1 представляет собой С-кон-цевой фрагмент молекулы размером 159 (IL-la) или 153 (IL-1P) аминокислот. Обе формы
21.1.2.3. Дальнейшие перспективы
Тот факт, что растворимые макромолекулы, синтезируемые макрофагами, усиливают секрецию IL-2, в существенной степени помог объяснить необходимость макрофагов для Т-клеточного пролиферативного ответа in vitro. Еще предстоит выяснить, объясняется ли обнаруженная гетерогенность IL-1 по заряду наличием нескольких родственных, но не идентичных пептидов или же вариация заряда обусловлена разной степенью гликозилирования одного и того же пептида. Следует также подчеркнуть, что при использовании современных методов биохимической очистки микрогетерогенность пептида может остаться незамеченной. Поэтому следует соблюдать осторожность, приписывая способность вызывать митоз Т-лимфоцитов лишь одному полипептиду. Аналогичным образом, прежде чем считать, что пептид известный нам как IL-1 (определяемый по пробе на пролиферативную активность тимоцитов), проявляет несколько биологических активностей, следует провести биологические испытания гомогенного пептида. Что касается влияния IL-1 на Т-клетки, остается неясным, действует ли он на определенную субпопуляцию Т-клеток или его мишенями являются все Т-клетки. Кроме того, остается открытым вопрос, ограничивается ли действие IL-1 стимуляцией секреции IL-2 или он вызывает в Т-клетках и другие изменения. По-видимому, индуцируемая лектином (или антигеном) способность Т-клеток отвечать на IL-2 не зависит от IL-1, поскольку IL-2 вызывает митоз активированных лектином Т-клеток и в отсутствие IL-1 и макрофагов [32]. Не обнаружено и синергизма в действии IL-1 и IL-2 на скорость роста клонов IL-2-зависимых цитолитических Т-лимфоцитов, неспособных к самостоятельному синтезу IL-2. Однако большая часть данных говорит о том, что клетки, синтезирующие IL-2, являются для IL-1 клетками-мишенями и что IL-1 стимулирует рост этой субпопуляции Т-клеток либо прямо, либо усиливая секрецию IL-2.
