Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
Чтобы найти экспериментальные подходы к изучению лимфокинов, которые могут рассматриваться как продукты лимфоцитов, отличные от антител, целесообразно ознакомиться с развитием представлений о структуре и функции антител. До того как была выяснена структура иммуноглобулинов, проблемы, стоявшие перед исследователями, не слишком отличались от тех, с которыми сталкиваются на современном этапе исследователи лимфокинов. Тут следует напомнить, что прежде при классификации антител исходили из их основной функции, обнаруживаемой в опытах in vitro. Так, в свое время мы говорили об агглютининах, преципитинах, опсонинах и гемолизинах. Произошедшая позднее дифференциация этих кажущихся различными функций и соотнесение их
с определенными классами иммуноглобулиновых молекул стали возможными благодаря использованию клеток, секретирующих один тип антител. Несмотря на то что концентрация антител в плазме крови очень велика (например, содержание сывороточного IgG составляет 10~4 М), гетерогенность и разнообразие иммуноглобулиновых молекул существенно затрудняли выяснение структуры и функции каждой отдельной молекулы. Поэтому, когда выяснилось, что плаз-мацитомы секретируют в больших количествах моноклональные антитела, исследователи получили клеточные и молекулярные инструменты, необходимые для исследования структуры иммуноглобулинов. Кроме того, установление структуры иммуноглобулинов было существенно для понимания их функции.
Особенно примечательно существование определенных параллелей между современным состоянием наших представлений о лимфокинах и состоянием иммунологии до выяснения структуры антител. Лимфокины были обнаружены и названы в соответствии с функциональными свойствами, проявляемыми в опытах in vitro. Поэтому, подобно агглютининам и гемолизинам в прошлом, мы использовали такие термины, как лимфоцит-активирующий фактор, фактор, заменяющий Т-клетки и хелперный фактор клеток-киллеров. Однако в отличие от ситуации, с которой мы столкнулись при изучении иммуноглобулинов, лимфокины действуют в значительно более низких концентрациях. Большая часть данных (в тех случаях, когда подобные данные имеются) свидетельствует о том, что лимфокины проявляют активность в области концентраций от 10-10 до 10~12 М. Эти концентрации очень близки к тем, которые встречаются в большинстве эндокринных систем, и наша экспериментальная задача заключалась в выделении индивидуальных лимфокинов из надосадочной жидкости, получаемой при культивировании лимфоцитов и содержащей сложный, функционально разнообразный набор полипептидов, каждый из которых присутствует в очень низких концентрациях.
Решение подобной задачи осложнялось заметной гетерогенностью клеток-мишеней. Становилось все более очевидным, что лимфоциты, гомогенные морфологически, в действительности весьма гетерогенны функционально. Основная причина, обусловившая обнаружение большого количества на первый взгляд непохожих лимфокинов, заключалась в том, что эти соединения различали и называли, исходя из опытов in vitro, в которых использовались гетерогенные клеточные популяции. На первых порах делалась попытка выделить и охарактеризовать индивидуальные лимфокины, используя в качестве источника культуральную среду, в которой могло содержаться несколько похожих, но неидентичных лимфокинов, и применяя тест-системы, содержащие не менее гетерогенные смеси лимфоцитов-мишеней. Помимо этих трудностей большинство используемых систем тестирования требовало длительного культивирования клеток, и поэтому конечный результат мог быть обусловлен рядом клеточных реакций, в которых могли принимать участие несколько лимфокинов. Например, для образования антителосекретирующих клеток из малых покоящихся В-лимфоцитов требуются переход последних в активированное состояние, пролиферация, дифференцировка в клетки, секретирующие иммуноглобулины, и последующее переключение биосинтеза изотипа тяжелой цепи.
Как станет очевидным из дальнейшего обсуждения, первоначальное решение этого казалось бы неразрешимого вопроса, связанного с гетерогенностью лимфокинов и клеток-мишеней, сводилось к развитию методов выделения клонов функционально активных клеток-мишеней. Только исключив гетерогенность этих клеток, стало возможным приступить к индивидуальной характеристике огромного числа лимфокинов. Однако выделение и характеристика лим-
фокинов — дело не столь простое, как это может показаться с первого взгляда, даже при использовании однозначных, быстрых, количественных биологических методов, которые появились благодаря наличию моноклональных, функционально активных популяций клеток-мишеней. Примером может служить прошлый опыт изучения иммуноглобулинов, а также более поздний опыт успешного выделения интерферона. В обоих случаях ключом к успешной очистке этих биологически активных соединений явился правильный выбор источника материала. Доктор Эдвард де Мейер (Edward de Маеуег) так суммирует опыт работы с интерфероном:
«Почему выделение интерферона заняло 20 лет? В 1958 г. наши системы генерации интерферона давали около десяти ед/мл, и большинство исследователей работали с разведениями активных супернатантов в интервале от 1 : 2 до 1 : 5.В это время для выделения 1 мг интерферона необходимо было 250 ООО л неочищенного супернатанта! Путем селекции высо-копродуцирующих клеток, скорее благодаря удаче, чем мудрости, а также в результате изучения фундаментальных основ процесса образования интерферона наступил момент, когда выход этого белка достиг 105— 10® ед/мл и для получения 1 мг требовалось 25 л культуральной среды. Таким образом, одним из решающих факторов в успешном выделении интерферона было значительное увеличение эффективности его образования (12], стр. 313)».
