Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дэвид Г. -> "Иммунология. Том 2" -> 143

Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.

Дэвид Г., Томас Дж. Иммунология. Том 2 — М.: Мир, 1987. — 456 c.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка): immunologiyat21988.djvu
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 283 >> Следующая

17.2.2. Методы
Основным методом обнаружения антигенов клеточной мембраны служит цитотоксический тест, в котором антитела и кроличий комплемент вызывают лизис клеток, измеряемый по поглощению клетками трипанового синего или по выходу из клеток 51Сг. Используются и другие методы, такие, как флуоресценция и связывание антител, меченных радиоактивными изотопами. В последнее время для тестирования антител стали использовать также проточную микрофлу-ориметрию (гл. 29) и определение молекулярной природы антигена клеточной мембраны. Молекулярную массу таких антигенов можно определять, вводя радиоактивную метку в антиген либо прямо на поверхности (при помощи 1251 в реакции, катализируемой лактопероксидазой), либо «изнутри» (используя 368-метионин или другие аминокислоты). Клетки солюбилизируют детергентом (обычно нонидетом Р-40), к раствору добавляют антитела и получают преципитат. Этот материал растворяют кипячением в растворе додецилсульфата натрия (ДСН) и подвергают электрофорезу в присутствии ДСН. Молекулярную массу определяют по относительной подвижности меченого антигена.
17.2.3. Принципы и проблемы
Ранее мы уже обсуждали проблемы, связанные с использованием обычных антисывороток [1] (табл. 17.2). Получение моноклональных антисывороток позволило преодолеть многие из этих проблем (гл. 28) — такие, как полиспецифичность антисывороток, наличие в антисыворотках противовирусных антител и аутоантител, осложнения, возникающие при повторном получении антисывороток с теми же свойствами или при получении этих сывороток в больших
Таблица 17.2. Принципы анализа мышиных аллоантисывороток
Метод исследования
Получаемая информация
Распределение по линиям Инбредные Конгенные
Рекомбинантные инбредные (РИ) Возвратные скрещивания
Распределение по тканям
Лимфоидные ткани (тимус, лимфатические узлы, селезенка, костный мозг, кровь)
Другие ткани (почки, печень, сердце и т. д.)
Адсорбция клетками разных линий и тканей
Химическое строение Одномерный и двумерный электрофорез в восстанавливающих условиях и в нативной форме
Поверхностное и внутреннее «мечение» молекулы Эксперименты с импульсной меткой Проточная микрофлуориметрия
Анализ связывания разных радиоактивно меченных моноклональных антител Функциональные тесты
Уникальное распределение но линиям указывает на наличие нового локуса: исследование конгенных линий выявляет идентичность или сцепленность исследуемого локуса с известными локусами; с помощью РИ-ли-ний определяется сцепленность; возвратные скрещивания указывают число локусов, определяющих данный признак, и наличие сцеплен-ности с известными генетическими маркерами
Определяется распределение антигена. Иногда два антигена имеют одинаковое распределение по линиям, но разное распределение по тканям: в этом случае они, по-видимому, являются продуктами разных локусов
Необходима для очистки многокомпонентных аллоантисывороток; не требуется для моноклональных антисывороток, кроме тех случаев, когда устанавливаются слабая перекрестная реактивность или различия в экспрессии антигена
Уникальная полоса или пятно на геле указывает на молекулярную массу антигена и свидетельствует об уникальности соответствующего гена; определяются наличие связей —S — S —, внутриклеточное или поверхностное расположение антигена; анализ молекул предшественников антигена
Распределение по клеткам, плотность антигена, разделение клеток для функционального Анализа
Взаимоотношения разных эпитопов на одной молекуле, определение аффинности
Определение функциональной активности субпопуляции, несущей данный антиген
количествах, и, наконец, необходимость адсорбировать сыворотки для получения антител требуемой специфичности. В то же время при работе с моноклональными антителами приходится по-прежнему проводить тестирование на животных множества различных линий, включая конгенные и рекомбинантные линии, на различных тканях животных одной линии (как лимфоидных, так и нелимфоидных). Иными словами используются те же принципы, что и при работе с обычными антисыворотками, но отпадает необходимость адсорбировать сыворотки. Использование моноклональных антител легло в основу несколь-
ких новых методов. Один из них заключается в следующем: исследуют соотношение различных эпитопов на одной молекуле, определяя способность одного моноклонального антитела подавлять связывание с тем же антигеном другого радиоактивно меченного моноклонального антитела.
Получено множество ксеногенных моноклональных антител, распознающих «мономорфные» детерминанты. Так, например, крысиные антитела к мышиному антигену Ly-5 (Т-200) распознают на этой молекуле такую детерминанту (или детерминанты), которая имеется у мышей всех линий. Моноклональные же аллоантисыворотки распознают «полиморфные» детерминанты этого антигена (Ly-5.1 и Ly-5.2). Поскольку антисыворотки двух этих типов реагируют с разными детерминантами на одной и той же молекуле, их используют в различных случаях.
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 283 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed