Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
8. Полученные результаты выражают в виде графика, который строят, откладывая по оси ординат процент связанной метки, а по оси абсцисс — логарвфм концентрации ставдарта (см. рис. 1.3)
9. Рассчитывают количество ПЛЧ в определяемом образце так, как это показано на рис. 1.4
Примечания. Описанная вмше методика выбрана произвольно из большого числа возможкмх вариантов, многие из которых уже обсуждались (см. общие замечания к табл. 1.2). Следует подчеркнуть, что эОО-кратное разаеденне антнсыворотки выбрано произвольно; для каждой антнсыворотки необходимо подобрать подходящее разведенке. Требуемая степень разведения в десеисибилизацноииых методах анализа описанного типа вависит от отвосительиого избытка антнсыворотки и не может, следова* тельно, быть экстраполирована) исходя из кривой разведения связыааю:цего агента (см. разд. 8.3)
фазами. В нижнем участке кривой соотношение между суммарными концентрациями лиганда и связывающего агента таково, что большая часть лиганда находится в свободной форме. Между этими двумя экстремальными ситуациями имеется интервал концентраций лиганда, в пределах которого относительно небольшие изменения вызывают значительные сдвиги в распределении лиганда между свободной и связанной фазами. В случае примера, представленного на рис. 1.3, этот интервал расположен между 0,032 и 2. С практической точки зрения наиболее крутая часть кривой соответствует тому интервалу, в котором определение может быть эффективным.
Построение калибровочной кривой является основным условием количественного определения лиганда в исследуемом образце. Если вместо стандарта взять исследуемый образец и использовать те же фиксированные концентрации связывающего агента и метки, то найденное распределение метки между связанной и свободной фазами будет соответствовать некой величине на горизонтальной оси калибровочной кривой. Определить эту величину можно путем простой экстраполяции (рис. 1.4).
Способы построения кривых разведения связывающего агента и калибровочных кривых описаны в табл. 1.2 и 1.3 и на рис. 1.5—1.7. Следует подчеркнуть, что эти описания, так же как и встречающееся в тексте изложение всех других деталей методических приемов, приводятся лишь в качестве примеров. В принципе возможно огромное число различных модификаций, касающихся используемых буферов, объемов, а также времени и температуры инкубации. Некоторые из этих модификаций не оказывают существенного влияния на результаты, тогда как другие, относящиеся, например, к порядку добавления реагентов, могут оказывать очень сильное влияние, и мь| остэноримря на них в последующих гдавз*.
4,9мл fytpepa
О,/мл исходной антисыворотни
Разведете/ :50
/мл 5t/tp'epa
/мл лнтисыеорот/м в разведении /•¦50
й, Разведение/‘/00
I
/мл ffypepa || /мл антисшоротни в разведении h/00 3 р Разведение /:2$0
I
Рис. 1.5. Двукратные разведения аитисыворотки (см. табл. 1.2).
0,05мл сь/ворот/ги
0,25мл анти-а/воротни данногоразве-дения
0,2 мл мет/ги
Ян/гудация в течение /часа
'мл 20%-наго раствора лолизтиленгли/галя
| //ервмегггиеак/т, — центриругирг/ют, разделяют, измеряют радиоа/гтивностг>
Рис.
1.6. Методика, используемая при построении кривой разведения аитисыворотки
(см. табл. 1.2.).
Стандарта, м/ге/мл
I '&! I
§<§ § / «I.
111 l| || М ^ 15 ^ *****
1
1
1
Lweopom/ra,
сво&одна& от//АЧ,мл— п пк ппк — — ___ — — —
р™мЖ!%?'а ~ 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
Растеорметич/, мл 0,20,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Лггтасыеоро/тгна.мл -о,25 - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
fy/ревдля ---- 025 ----- -
разведения, мл
Рис. 1.7. Состав проб, используемых при построении калибровочной кривой, н соответствующих контрольных проб (см. табд. I.?).
1.6. Способы построения калибрсвсчнсй кривой
В случае, показанном на рис. 1.3, мы воспользовались полулогарифмическим способом построения кривой, при котором вдоль одной оси отложен процент связанной метки, а вдоль другой — логарифм концентрации немеченого лиганда. Этот способ построения калибровочной кривой получил широкое распространение, однако наряду с ним существует большое число других способов выражения тех же данных. Независимую переменную в некоторых случаях выражают способом, включающим использование арифметической шкалы концентрации стандарта. Получаемая в результате кривая (по оси ординат, как на рис. 1.3, откладывается процент связанной метки) изображена на рис. 1.8. В отличие от этого для выражения зависимой переменной имеется несколько возможностей. Чаще всего пользуются отношением связанного лиганда к свободному; на рис. 1.9 и 1.10 этот способ выражения зависимой переменной дан в арифметической и логарифмической форме. Можно также использовать обратную величину, а именно отношение свободного лиганда к связанному (рис. 1.11 и 1.12). При нанесении процента связывания результаты обычно выражают в процентах от связывания при «нулевом стандарте», т. е. в пробе, содержащей заданные количества метки и связывающего агента, но не содержащей немеченого лиганда (эту величину иногда называют холостой пробой на антитела). Такой вариант представлен на рис. 1.13. Наконец, ответ переменной может быть выражен с помощью нескольких сложных преобразований, среди которых наиболее широко распространено преобразование, известное под названием logit (Rodbard, Lewald, 1970):
