Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Для определения истинной природы анализируемого материала большую ценность могут представлять физико-химические исследо$ания. Например, результаты можно считать
более достоверными, если показано, что при хроматографировании в нескольких системах растворителей вещество, затрудняющее взаимодействие между связывающим агентом и лигандом, обладает такими же свойствами, как известное синтетическое соединение (рис. 9.7). Наконец, и это, вероятно, особенно важно, каждый раз необходимо исследовать результаты анализа в биологическом аспекте. Иными словами, нужно показать, что результаты анализа сравнимы с теми, которые следовало бы ожидать на основании других сведений об анализируемом лиганде. Так, для многих гормонов можно получить данные об их концентрации в крови косвенным путем, исходя из продолжительности жизни гормона и количества экзогенного гормона, вызывающего максимальный ответ эффекторного органа. Если найденный в результате анализа уровень значительно превышает величины, полученные косвенными методами, то с большой долей вероятности можно предположить влияние неспецифических факторов. Определяемые при анализе величины должны также подвергаться соответствующим колебаниям в зависимости от физиологических— нормальных или патологических — условий; после введения кортикостероидов определяемый базальный уровень АКТГ должен снизиться или вообще исчезнуть.
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ: ТОЧНОСТЬ
10.1. Определения
Задачей метода связывания является определение истинной концентрации лиганда в биологической жидкости. Практически, однако, получаемая концентрация будет отличаться от истинной, с одной стороны, из-за неточности анализа и, с другой стороны, из-за недостаточной достоверности результата. Поскольку понятия точности и достоверности часто пута-ют,, имеет смысл определить эти два термина, по крайней мере так, как они используются в этой книге (см. также рис. 10.1). Под термином «точность» (в качестве синонима которого часто пользуются словом «воспроизводимость») мы будем понимать величину, характеризующую различия между результатами параллельных анализов одного и того же образца. Термин же «достоверность» характеризует степень приближения найденной концентрации к ее истинному значению; очевидно, что достоверность анализа связана с его специфичностью. Так, например, метод анализа, в котором эндогенный лиганд реагирует со связывающим агентом иначе, чем стандарт и меченый лиганд, в принципе не может дать достоверного результата (если, конечно, не будут введены соответствующие поправки), хотя он может быть точным. Следовательно, можно считать, что термин «достоверность» в том смысле, в каком мы будем им пользоваться, практиче-ски совпадает с некоторыми другими терминами, такими, как «специфичность» (см. гл. 9). В этой главе будут рассмотрены факторы, влияющие на точность анализа, а также способы Оценки точности и пути ее повышения.
10.2. Факторы, влияющие на точность
Факторы, влияющие на точность анализа, можно разделить на две группы. К первой относятся ошибки, обусловленные природой используемых реагентов и методикой проведения анализа, а ко второй — ошибки, возникающие в самом
'Зысо/гея
Мгзтяг*
Xiramnr
Ъшмфт.
Выее/ггнг
Яазжвя •ягввер, ffrs/r/nr
WWMm/raxur
штаг
Л70У//0С/776 •
• •
•
• • •
• • •• • •
• • •• •• •
• • • • • • •
• • • • • •
• • • •
---> м - ---«_•.«--- -------- _ --- -
• • • • •
• • •
• •
•
-•
- -/гмяея/7г/иг1(г/& лиганда
Рис. 10.1. Теоретические диаграммы разброса величин, иллюстрирующие понятия «точность» (т. е. разброс даиных при повторных определениях) и «достоверность» (т. е. степень соответствия найденной концентрации вещества нстнвной его концентрации).
процессе определения. Практически обе группы тесно связаны между собой.
10.2.!. Ошибки, сви8иииые в реагентами и методикой
10.2.1.1. Ошибки, связвииые о еевовиымв реагеитвми
Неточность очень редко бывает связана с серьезной ошибкой в приготовлении растворов реагентов (за исключением стандартов). В связи с этим не имеет смысла, как это часто делается, сравнивать точность различных способов анализа (и в частности, разных наборов для радиоиммунологического определения) на основании абсолютного числа импульсов в единицу времени или процента связывания в параллельных определениях. При прочих равных условиях главным фактором, определяющим эти различия, является техническая квалификация оператора (или же точность работы прибора), которая не имеет непосредственного отношения к реагентам. Может, однако, возникнуть специфическая ошибка (и ее следует избегать), связанная с неполным перемешиванием основных реагентов, поскольку неполное перемешивание может привести к гетерогенности раствора и отбираемых из него аликвот. Такого рода гетерогенность часто наблюдается при размораживании замороженных растворов и при повторном растворении лиофилизованного материала.
