Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Рас. 9.6. Ферментативное расщепление меченого лиганда. Окситоцнн, меченный изотопом 1И1. инкубировали с антнсывороткой, специфичной к окснтоцину, и с плазмой в различных концентрациях, полученной от женщин в поздних стадиях беременности а не содержащей окснтоцнна (ось абсцисс). Через 24 ч инкубации в пробах» содержащих плазму в наиболее высоких концентрациях» связанный гормон практически от* сутствовал. Потеря иммунной активности **1-окснтоцнном обусловлена его разрушением окснтоциназой — ферментом плацентарного происхождения.
место и в случае стероидных гормонов. В этих условиях поверхность может конкурировать со связывающим агентом за меченый илн немеченый лиганд, причем этот эффект сильно зависит от природы других компонентов, присутствующих в пробирке при анализе. Наконец, биологические образцы могут содержать антитела, специфичные по отношению к лиганду; примером может служить сыворотка больных диабетом после лечения инсулином. В зависимости от системы* используемой для разделения, это явление может приводить к значительным расхождениям результатов цз-за конкуренции за меченый лиганд между эндогенными и добавленными антителами.
9.3.4. Разрушение или инактивация иемеченоге яигаида
Описанные выше эффекты могут также относиться и к немеченому лиганду. Особенно велика их вероятность во время сбора, подготовки и хранения образцов. Например, небольшие пептиды могут легко разрушаться эндогенными ферментами и обладают сильно выраженной способностью необратимо адсорбироваться на стенках шприцев и пробирок, особенно если последние изготовлены из стекла.
9.3.5. Обнаружение и устранение ноопоцифичоокой неопоцифичнооти
Традиционный способ обнаружения неспецифичности любого вида заключается в исследовании параллельности кривых, полученных разбавлением анализируемого раствора и стандарта. Однако так же, как и в случае специфической неспецифичности, параллельность кривых может ввести в заблуждение и не является гарантией идентичности. Одновременно следует применять и другие подходы.
Наиболее надежный способ исключения неспецифической неспецифичности состоит в том, чтобы обеспечить по возможности идентичность общего состава анализируемого образца и стандарта. Если, например, анализируемой жидкостью является сыворотка, а стандарты приготовлены на сыворотке, не содержащей лиганда, то в этом случае не возникает никаких проблем. Сложности появляются при анализе жидкостей, состав которых может меняться в широких пределах (например, мочи), а также, что еще более важно, в тех случаях, когда жидкость, не содержащая лиганда, труднодоступна.
Существуют два возможных источника получения биологической жидкости, не содержащей лиганда. Первым и наиболее надежным источником являются пациенты, у которых данный лиганд полностью отсутствует. В случае анализа гормонов такую жидкость можно получать от больных, у которых удалены железы, секретирующие эти гормоны (см., однако, разд. 6.1), или секреция этих гормонов подавлена соответствующими лекарствами (например, секреция АКТГ подавлена дексаметазоном). В случае же анализа плацентарных продуктов источником свободной от лиганда жидкости могут служить небеременные женщины. Второй путь получения биологической жидкости, свободной от лиганда, состоит в удалении эндогенного лиганда из биологической жидкости путем его извлечения при помощи какого-то адсорбента; типичным примером может служить удаление инсулина или тироксина из сыворотки с помощью активированного угля. Проблема, возникающая при реализации этого пути, связана, однако, с тем, что одновременно с лигандом из жидкости могут извлекаться также факторы, с которыми может быть связана неспецифичность системы. Из сказанного следует, что так называемая свободная от гормона сыворотка не адекватна свежей нормальной сыворотке и может давать неверные результаты.
В тех случаях, когда нельзя гарантировать тождественность состава анализируемых образцов и стандартных растворов, в частности при отсутствии надежного источника свободной от лиганда сывороткц, можно использовать ряд до-
Рис. 9.7. Тонкослойная хроматография экстракта мочи после адсорбции на поверхности стеклянных бус и последующей элюцни (см. разд. 6.1.2 и табл. 6.1). Каждый участок пластинки экстрагировали 1 мл 60%-ного (вес/объем) водного ацетона. Экстракт упаривали; сухой остаток растворяли в водном буферном растворе и инкубировали в прн* сутствии 0,05 нг 1251-окситоцнна и специфичной по отношению к окснтоцину аитисыво-ротки кролика прн конечном разведении 1 :4000. /— моча, к которой не был добавлен гормон; //—моча, к которой был добавлен синтетический окситоцин; ///—синтетический окснтоцин. двигавшейся на то.й же пластинке. Заметим, что подвижности эндогенного и извлеченного нз мочи экзогенного гормонов практически идентичны. Однако ин в том, ни в другом случае подвижность гормона не идентична подвижности чистого синтетического окснтоцина, что указывает на некоторое изменение гормона при его добавлении к моче и экстракции нз нее.
полнительных приемов, позволяющих устранить неспецифич-ность или по крайней мере решить вопрос о ее наличии. От многих возможных источников ошибок на уровне самого анализа можно избавиться при внимательном отношении к мето-дике. Такие факторы, как адсорбция меченого или немеченого лиганда из анализируемого раствора на стенках пробирки, могут быть выявлены путем добавления в пробирку меченого лиганда, последующего его извлечения и определения числа оставшихся импульсов. Методом проб и ошибок удается обычно подобрать пробирки, не адсорбирующие лиганд на своих стенках. Устранить возможность ферментативного расщепления можно (по крайней мере, частично) путем добавления в инкубационную среду таких ингибиторов ферментов, как трасилол. Экстракция и концентрирование лиганда (см. гл. 6) позволяют перенести материал из среды с неопределенным составом (такой, например, как моча или экстракт ткани) в водный буферный раствор известного состава. Однако сама операция экстракции, как уже отмечалось, может сопровождаться неспецифическими эффектами.
