Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
специфичности. К ЧИСЛу ВОЗМОЖНЫХ ПОДХОДОВ ОТНОСИТСЯ ВЫ'
бор схемы иммунизации, подбор условий анализа, а также удаление нежелательных популяций молекул путем истощения антисыворотки.
Схема иммунизации. Наиболее важным фактором при иммунизации является, очевидно, природа иммуногена. Не-специфичность типа В (рис. 9.1), связанную с присутствием 8 лиганде примесей, можно обойти путем использования (ec*
ли это возможно) чистого лигаида. Возможность такого подхода ограничена доступностью высокоочищенного вещества, а также тем фактом, что присутствующие в низких концентрациях примеси могут обладать высокой иммуногеи-ностью. Неспецифичность типа Б (рис. 9.1), обусловленную присутствием одинаковых антигенных участков в лиганде и родственном ему веществе, можно обойти путем использования в качестве иммуногена такого фрагмента лиганда, который не содержит общего антигенного участка. Хорошим примером могут служить гликопротеидные гормоны (ЛГ, ФСГ, ТТГ и хорионический гонадотропин человека), молекулы которых состоят из двух субъединиц: так называемой а-субъ-единицы, содержащейся во всех четырех гормонах, и Р-субъ-едииицы, которая во всех четырех гормонах неодинакова и определяет их биологическую специфичность. В связи с наличием общей а-субъединицы во всех гормонах при анализе интактных гормонов между ними часто наблюдается резко выраженная перекрестная реакция. В то же время использование р-субъединицы в качестве иммуиогена (а часто и в качестве меченого лиганда) позволяет разработать специфический метод анализа для каждого из гормонов. Недостаток такого приема заключается, однако, в том, что третичная структура выделенной субъединицы может отличаться от ее третичной структуры в составе интактной молекулы гормона и обладать в связи с этим другой антигенной структурой. Именно этим можно, по-видимому, объяснить, почему основанные на таком принципе методы анализа часто оказываются менее эффективными с точки зрения сродства антител и чувствительности по сравнению с менее специфичными методами, предназначенными для анализа интактных молекул.
В отличие от неспецифичности типа Б и В неспецифичность типа А (рис. 9.1), обусловленную взаимодействием одной гомогенной популяции антител с рядом сходных антигенных участков, нельзя исключить путем подбора иммуногена.
Подбор условий проведения анализа. Как уже отмечалось, специфичность метода анализа может варьировать в зависимости от выбранных условий. Так, иапример, при очень сильном разбавлении антисыворотки иеспецифичиость, обусловленная присутствием антител, обладающих низким сродством, может быть незначительной. В неравновесных методах анализа неспецифичность может быть связана также с-коротким периодом инкубации, поскольку в этих условиях связывание лиганда и перекрестно-реагирующего вещества может быть практически одинаковым, и только в состоянии равновесия благодаря относительно большей скорости диссоциации примеси анализируемый лчганд будет связан 8 относительно
большем количестве. Поэтому важно перепроверять специфичность антитела точно в тех же условиях, в которых проводится анализ. На специфичность также может влиять природа меченого лиганда: путем использования в качестве меченого лиганда высокоочищенного соединения можно обойти некоторые дефекты антисыворотки. Пример огромного эффекта, который может дать использование различных меченых лигандов в сочетании с одной и той же антисывороткой, показан на рис. 2.1, А и Б.
Удаление нежелательных популяций антител методом истощения. От неспецнфичности типа Б и В можно избавиться путем предварительного истощения антисыворотки: в случае неспецнфичности типа Б с этой целью используют очищенный препарат фрагмента, содержащего общий антигенный участок, а в случае неспецнфичности типа В — препарат загрязняющего вещества. Иногда комбинируют оба приема. На-пример, в ранних методах анализа гонадотропинов было принято проводить истощение антисыворотки, специфичной по отношению к человеческому ФСГ, при помощи хорионического гонадотропина человека. Такой прием давал два эффекта: во-первых, удалялись популяции антител, специфичных по отношению к обшей а-субъединице, и, во-вторых, благодаря близкому сходству между Л Г и ХГЧ удалялись популяции антител, специфичных по отношению к Л Г, образование которых было связано с загрязнением лютеинизирующим гор-моном препаратов ФСГ, применяющихся в качестве иммуио-гена. Устранение неспецнфичности типа Б путем истощения может быть также использовано для получения специфического метода анализа так называемого неоан^игена — антигена, представляющего собой фрагмент молекулы, который благодаря специфике третичной структуры обладает антигенными свойствами, отсутствующими у интактной молекулы. В качестве иллюстрации можно привести' метод анализа продуктов распада фибриногена (рис. 9.4). Антисыворотка, специфичная по отношению к концевому фрагменту D, содержит антитела, специфичные к самому фрагменту D, а также антитела, способные взаимодействовать с интактным фибриногеном. При истощении антисыворотки с помощью фибриногена последняя популяция удаляется, что дает специфичный метод для анализа фрагмента D, присутствие интактных молекул фибриногена в котором не сказывается на результате анализа.
