Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
1.5. Кривые разведения связывающего агента и калибровочные кривые
Исходя из основных принципов, рассмотрим два важных экспериментальных приема, используемых в методе насыщения, а именно построение кривых разведения связывающего агента и калибровочных кривых.
Кривая разведения связывающего агента (в случае радиоиммунологического метода это кривая разведения антител) строится путем инкубации фиксированного количества меченого лиганда с различными количествами связывающего агента (последние могут представлять собой, например, серию двукратных разведений антисыворотки) .После инкубации измеряют распределение метки между свободной и связанной фракциями. Общий вид кривой такого типа показан на рис. 1.2. При нанесении по одной из осей процента связанной метки, а подругой оси — логарифма серийных разведений получают сигмоидную кривую. Первым этапом налаживания системы, используемой в методе связывания, после приготовления набора реагентов является построение кривой разведения связывающего агента, поскольку полученные результаты позволяют' определить то оптимальное количество связывающего агента, которое используется затем для построения калибровочной кривой,
Концентрация сеязьюающега агента
Рас. 1.2. Кривая разведения связывающего агента (например, кривая разведения антител). Серию разведений связывающего агеитз (ось абсцясс) инкубируют с фиксированным количеством меченого лиганда и отклздывают по оси ординат процент связанной метки. В методах связывания используют, как правило, такое разведение связывающего агента, прн котором связывается 50% метки; оцнако существует немало исключений нз этого правила. Приведенная кривая получена с помощью математической модели метода связывания (см. разд. 1.9).
Для построения калибровочной кривой, как правило, подбирают такую концентрацию связывающего агента, при которой связывается приблизительно 50% метки (рис. 1.2). Позже мы остановимся на исключениях из этого правила. Очевидно, что при такой концентрации связывающего агента, при которой связывается только 50% метки, дальнейшее добавление лиганда должно приводить к значительно большему увеличению метки в свободной фракции по сравнению со связанной. Если же, напротив, будет выбрана более высокая концентрация связывающего агента (например, 2,5 на рис. 1.2), то для того, чтобы вызвать заметный сдвиг в свободной и связанной фракциях, потребуется значительно большее количество лиганда, и в конечном счете чувствительность метода будет снижена.
Для построения калибровочной кривой проводят инкубацию фиксированных количеств меченого лиганда и связывающего агента с различными концентрациями чистого немеченого лиганда. Кривая, построенная в координатах процент связанной метки — логарифм серийных разведений лиганда, и в этом случае имеет сигмоидный характер (рис. 1.3). Верхняя часть кривой соответствует таким малым количествам немеченого лиганда, которые вызывают относительно небольшие сдвиги в распределении метки между свободной и связанной
концентрация шанёартяяг# рястеяра ¦
Рис. 1.3. Калибровочная кривая. Фиксированные количества меченого лиганда и связывающего агента (связывающий агент в концентрации» указанной на рис. 1.2) инку бируют со стандартными растворами немеченого лигаида различной концентрации (ось абсцисс). По мере увеличения концентрации стандарта процент связанной метки (ось ординат) постепенно уменьшается. Заметьте* однако, что, согласно рве. 1.1, по мере уменьшения процента связанного лигаида общее количество связанного лиганда (меченый + немеченый лиганд) в действительности увеличивается.
50г
Рис. 1.4. Определение количества лиганда в неизвестном образце е помощью калибровочной кривой. Условия те же. что и на рис. 1.3. Анализируемый образец ннкубнрутот с растворами связывающего агента й метки известной концентрации. Количество связанной метки в анализируемом образце составляет около 34%, что соответствует количеству стандарта 0,128; эта величина и есть, следовательно, концентрация лигайН в анализируемом образце.
Таблица 1.2
Построение кривых разведения связывающего агента
(радиоиммунологический метод определения плацентарного лактогена человека)
Буфер для разведения — 0,Q5 М фосфатный буфер, pH 7,5, содержащий 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (методику приготовления буферов см. в табл. 1.4)
1. Путем двукратных разведний готовят серию стандартных растворов аитисыворотки к ПЛЧ в 1 мл буфера (см. рис. 1.5 и 1.6). Разведение для различных антисывороток может быть разным, но, как правило, оно лежит в пределах 1 : 100— 1 : 100000
2. В двойной ряд пробирок разливают по 0,25 мл антисыворотки каждого разведения; одна пара пробирок содержит буфер без аитисыворотки и служит в качестве холостой пробы
3. В каждую пробирку добавляют 0,2 мл раствора 1251-ПЛЧ, разбавленного из такого расчета, чтобы общее число импульсов на пробу за 10 с лежало в пределах 10 000—15 000. Для определения общей радиоактив-иости одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый лиганд
