Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
8.6. Выводы
Проблема оптимизации затрагивает самую суть радиоим-мунологического и родственных ему методов анализа. Все другие аспекты, и в частности приготовление и проверка реагентов, по существу непосредственно вытекают из общих представлений химии и биохимии. Полное понимание принципов, которыми надлежит руководствоваться при разработке методики анализа, является наиболее характерной чертой опытного специалиста, работающего в этой области.
Основное внимание в этой главе было обращено на правильное определение понятия чувствительности применитель^ но к данному методу анализа и пути достижения максимальной чувствительности, а также на такой важный вопрос, как направленность методики анализа на ее предполагаемое практическое использование, поскольку возможность практического применения метода анализа является единственным критерием его ценности.
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ: СПЕЦИФИЧНОСТЬ
9.1. Определение понятия «опецифичнооть»
Специфичность метода анализа можно определить как степень влияния на результат анализа веществ, отличных от анализируемого вещества. Слово «степень» имеет в данном случае относительное значение, поскольку оно может варьировать в зависимости от условий проведения анализа (от концентрации меченого лиганда и связывающего вещества, от метода разделения и т. д.). Так, в случае радиоиммунологического метода анализа можно так подобрать условия, что при одной концентрации антитела перекрестно-реагирующие вещества практически не будут мешать анализу, тогда как при другой его концентрации их влияние будет настолько сильным, что практическая ценность метода сведется к нулю.
Вопрос о специфичности будет обсуждаться в двух разделах, которые для простоты и удобства озаглавлены «Специфическая неспецифичность» и «Неспецифическая неспеци-фичность». В первом случае имеется в виду вредное влияние веществ известной природы, которые по своим физико-хими* ческим свойствам сходны с лигандом и в связи с этим могут непосредственно взаимодействовать со связывающим аген-, том. Во втором случае имеется в виду вредное влияние веществ, которые хотя непосредственно и не реагируют со связывающим агентом, тем не менее могут влиять на основную реакцию между связывающим агентом и лигандом (так, например, реакция антиген — антитело может частично или полностью тормозиться в присутствии кислот). Иногда бывает трудно четко разделить указанные два типа неспецифич-ности, однако с практической точки зрения это очень важно сделать, поскольку пути устранения двух видов неспецифич-ности анализа могут быть совершенно разными.
9.2. Специфичеокая неспецифичность
Существует много групп веществ биологического происхождения, состоящих из соединений, очень сходных в физико-химическом отношении; таковы, например, группы стеро«
идиых гормонов и гликопротеидных гормонов передней доли гипофиза (ЛГ, ФСГ, ТТГ). Специфичность их фйзиологиче-ского действия определяется присутствием в органах-мишенях рецепторов, способных различать эти гормоны благодаря незначительным различиям в структуре их молекул, например по наличию илн отсутствию гидроксильной группы. При использовании таких рецепторов в анализах, основанных на ме-тоде связывания, их специфичность сохраняется и при измерениях in vitro. Однако применение рецепторных методов анализа ограничено относительно небольшим числом веществ; очевидно, что эти методы нельзя применять для анализа веществ негормональной природы (в том числе важных продуктов превращения биологических соединений), поскольку для иих не существует органов-мишеней. Для большинства! целей пришлось поэтому использовать другие типы связывающих агентов — главным образом природные связывающие белки крови и антитела, которым и будет преимущественно посвящено обсуждение.
9.2.1. Основа специфической неспецифичнссти
Антисыворотка, специфичная по отношению к какому-либо веществу, обычно реагирует, хотя н менее эффективно, и с другими родственными ему веществами. Существуют три основные причины такого явления. Во-первых, одна и та же гомогенная популяция антител может реагировать с целым рядом родственных между собой лигандов, причем для каждой такой реакции характерно свое значение константы сродства К. Во-вторых, антисыворотка может содержать различные популяции молекул антител, одна или несколько из которых могут быть специфичными по отношению к такому участку молекулы антигена, который имеется и в родственных ему соединениях. И наконец, в-третьих, антисыворотка может содержать антитела, специфичные по отношению к примесям, присутствующим как в препарате лнганда, так и в анализируемом материале (рис. 9.1). Примеры ситуации такого рода будут рассмотрены в разд. 9.2.2 и 9.2.3.
Эти представления имеют важное значение для понимания наблюдаемых в эксперименте явлений параллельности и непараллельности. Если различие между родственными соединениями сводится просто к различию характерных для ннх констант сродства при связывании с одним и тем же гомогенным связывающим агентом, то при использовании гомологичного меченого лиганда они дадут параллельные калибровочные кривые. Кривые», однако, не будут параллельными, если используется негомологичный меченый лиганд и его масса составляет значительную долю от общего количества прнсут-
