Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 51

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 100 >> Следующая

Примечание. В случае поступающих в продажу реагентов для каждой партии обычно указывается нужное разбавление. Однако при пользовании этими реагентами необходимо проверять их именно в тех условиях, в которых проводится анализ. Во многих случаях второй период инкубации можно сократить до 2 ч, если подобрать соответствующие условия.
5.3.5.2. Твердофвзный мотод двойных внтнтол
Связывание второго антитела с нерастворимой матрицей, такой, как, например, целлюлоза (den Hollander, Schuurs,
1971), создает удобную систему, не требующую гамма-глобулинов в качестве носителей. Это обстоятельство делает такую систему более экономичной и в отношении второго антитела. Однако приготовление иммобилизованных антител отнимает много времени, в связи с чем метод не получил широкого применения, за исключением тех случаев, когда в продаже имеются готовые реагенты (Organon).
5.3.6. Твердефазные системы
Если связывающий агент ковалентно связан с нерастворимым носителем, то этот связывающий агент и его комплекс с лигандом легко можно отделить от растворимого свободного лиганда (рис. 5.9). Описано большое число различных твердофазных носителей, в том числе гранулированный
Рис. 5.9. Разделение при помощи иммобилизованных аитнтел.
декстран (сефадекс и сефароза) и целлюлоза, а также носители, имеющие непрерывную поверхность, например частицы дискообразной формы из полистирола или из полипропилена или стенки пробирок, изготовленных из пластика. Рассмотрим отдельно каждый из этих двух типов носителей.
5.З.6.1. Связыввющнй вгонт, иммобилизованный нв дискообразных частицвх полимеров и иа стенках полимерных пробирок
Эти носители были использованы только для иммобилизации антител. Поверхность пластика обладает адсорбирующей способностью, в связи с чем даже при простом контакте разбавленной антисыворотки с такой поверхностью часть молекул антител будет на ней адсорбироваться (Catt,
Tregear, 1967). Очевидно, что в данном случае фиксация обусловлена не образованием ковалентных связей, а какими-то другими видами взаимодействий (ионными, гидрофобными и т. д.). Такие взаимодействия являются менее прочными по сравнению с ковалентными связями, образующимися в случае гранулированных твердофазных носителей. Именно этим, по-видимому, и объясняется главный недостаток указанных систем, а именно отсутствие воспроизводимости, который можно отчасти преодолеть, включив глутаровый альдегид или некоторые другие реагенты в раствор антител, используемый для покрытия. Отсутствие воспроизводимости может наблюдаться при сравнении не только разных анализов, но и отдельных проб, поскольку результаты зависят от выбора пробирки или полимера, а последние могут значительно варьировать от партии к партии. Второй недостаток метода заключается в более низкой по сравнению с другими методами эффективности, обусловленной тем, что об' щее количество связываемого меченого лиганда сравнительно невелико, что может приводить к кажущейся потере сродства. Вместе с тем пробирки с покрытием очень удобны в работе и широко применяются в наборах, предназначенных для продажи, в которых проблема воспроизводимости рГешается путем изготовления и тщательной проверки больших партий пробирок. Значительные возможности откры^ вают новые методы, позволяющие связывать антитела с поверхностью пробирок ковалентной связью, а также приемы, основанные на использовании специальных вкладышей для пробирок, сильно упрощающих проблемы производства. В одном из существующих вариантов пробирок в состав покрытия входит также меченый лиганд и при проведении анализа требуется только однократное добавление реагентов (Schwartz-Mann Ab-TRAC).
5.3.6.2. Связыввющий агент, иммобилизованный на гранулированном твердофазном носителе
Гранулированные твердофазные носители широко используются в различных методах анализа. Выделенные из антисыворотки гамма-глобулины иммобилизуют на гранулах при помощи одного из методов, позволяющих ковалентно связывать белок с гранулой, например путем диазотирования или цианогенбромидной активации (Wide, Porath, 1966). Полученный продукт тщательно промывают до полного удаления свободных молекул гамма-глобулинов (см. табл. 5.5). Интересные альтернативные подходы состоят в использовании антител, включенных в состав полиакриламидного геля (Updike et al., 1973) или ковалентно связанных с частицами,
Приготовление и использование иммобилизованных антител Радиоиммуиологический метод анализа плацентарного лактогена человека (модификация метода Gardner et al., 1974)
1. Выделяют из антисыворотки гамма-глобулиновую фракцию; с этой целью к 10 мл сыворотки добавляют 1,8 г безводного Na2SC>4, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 2000 g. Осадок дважды промывают 10 мл 18%-иого (вес/объем) раствора Na2S04 и растворяют в 10 мл 0,9%-ного раствора NaCl
2. Выдерживают 1 г сефарозы 4В (Pharmacia АВ), активированной циаио-генбромидом, для набухания в 10 мМ НС1. Эту операцию лучше всего проводить в воронке Бюхнера со стеклянным фильтром марки 4 Scinta. Добавляют 10 мМ НС1 (общий объем 200 мл) и отсасывают небольшими порциями
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed