Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Доступность связывающего агента является чисто практической проблемой; она хотя и не влияет на принципиальную характеристику метода, но тем не менее может определять выбор системы среди других систем, обладающих сходными характеристиками. Понятие доступности включает возможность получения связывающего агента, воспроизводимость от
препарата к препарату, стабильность при хранении и стоимость, а. также то количество, которое требуется с учетом этих факторов для проведения предполагаемого числа анализов.
4.2. Антитела
Антитела являются наиболее изученными и наиболее широко применяемыми связывающими агентами.
4.2.1. Химия антител
Молекулы антител, или иммуноглобулинов, обнаруживаются при электрофорезе сывороточных белков в медленно движущейся фракции — среди р- н углобулинов.. Иммуноглобулины четко делятся на пять классов, обозначаемых IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, причем иммуноглобулины всех классов имеют в своей основе общую структуру (рис. 4.1). Каждый класс обладает характерным спектром активности: например, в состав класса. IgE входят антитела, или реагины, ответственные за аллергические явления, такие, как, например, астма. К классу IgM принадлежат основные иммуноглобулины некоторых примитивных видов животных; у высших животных антитела, относящиеся к классу IgM, участвуют в самой ранней фазе иммунного ответа, а затем исчезают — пример повторения филогенеза в онтогенезе. С точки зрения радиоиммунологического метода анализа интерес представляет только один класс иммуноглобулинов— IgG, поскольку он включает огромное большинство антител, образующихся при специфической искусственной иммунизации. К классу IgG относится также большинство знакомых всем антител, обладающих специфичностью к бактериальным и вирусным антигенам и играющих поэтому важную роль в механизмах иммунной защиты организма.
Молекулы IgG состоят из четырех пептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидными мостиками (рис. 4.1): две из них носят название тяжелых цепей (или Н-цепей), а две другие — легких цепей (L-цепей). Общий молекулярный вес IgG равен приблизительно 160000. Для иммуноглобулинов других классов характерна такая же основная структура, однако они различаются по аминокислотной последовательности в константном участке Н-цепей и по способности образовывать полимеры. Например, молекулы IgM состоят из пяти основных единиц, связанных друг с другом с образованием кольцевой структуры. Различия в молекулярных весах, выражаемых обычно через коэффициенты седиментации, послужили основой для первоначальной классификации иммуно-
Рис. 4.1. Строение молекулы IgG, состоящей нз двух тяжелых (Н) н двух легких (L) цепей, соединенных днсуль-фидными мостиками (S).
Рис. 4.2. Расщепление молекулы IgQ папанном с образованней двух фрагментов Fab, каждый из которых содержит по одному связывающему участку антитела, и одного фрагмента Fc.
глобулинов, согласно которой они делились на две группы — 7S (большинство IgG) и 19S (IgM).
Первоначально функциональную активность различных участков молекулы IgG определяли, исходя из опытов, в которых очищенный IgG подвергали ограниченному перевариванию ферментами (Porter, 1959). Так, например, папаин расщепляет молекулу IgG на три фрагмента (рис. 4.2). Два из них идентичны и состоят из легкой цепи и соседнего участка тяжелой цепи; это фрагменты Fab (от англ. antigen-binding fragment, т. е. фрагмент, связыв’ающийся с антигеном), содержащие антигенсвязывающий участок молекулы. Третий фрагмент Fc представляет собой остальную часть молекулы; его название связано со способностью к кристаллизации. Фрагмент Fc наряду с остатками тяжелых цепей содержит углеводную часть молекулы IgG и отвечает за такие вторичные активности, как фиксация комплемента. Молекулы IgG могут расщепляться также пепсином с образованием двух фрагментов, один из которых Fc, а другой эквивалентен двум фрагментам Fab и обозначается как F(ab)2.
Структура фрагмента Fab была детально изучена при исследовании гомогенных белков миеломы. 'N-концевая половина молекулы Fab обладает большой вариабельностью и обозначается как V-участок (от англ. variable). С-концевая половина молекулы, напротив, обладает относительным постоянством и обозначается как С-участок (от англ. constant). Антитело связывается с антигеном своим вариабельным участком, и именно эта вариабельность, допускающая существование многих миллионов различных структур, обусловливает специфичность антител. В определенной степени эта вариабельность ответственна также за большую гетерогенность антител, образующихся в ответ на введение одного какого-то антигена. Молекулы г антител, образующиеся при иммунном ответе, содержат несколько различающиеся вариабельные участки,
Некоторые из этих молекул обладают высокой степенью комплементарное™ по отношению к антигену и прочно связываются с ним, тогда как для других характерна меньшая степень комплементарности и меньшая степень сродства; в результате образуется спектр антител с постепенно уменьшающимся сродством вплоть до величин, близких к неспецифическому связыванию. Гетерогенность популяции антител, проявляющаяся на графике Скэтчарда в виде нелинейного ответа (см. разд. 1.5), может быть следствием и других причин. Так, антигены более крупного размера, например некоторые белки, могут содержать несколько антигенных участков, каждый из которых будет связываться с разными популяциями антител, обладающих различными характеристиками. Кроме того, при связывании крупного антигена с одним из двух связывающих участков антитела большой размер молекулы антигена может в какой-то степени препятствовать связыванию второй молекулы антигена с оставшимся связывающим участком. Подобное явление должно проявляться в кажущемся снижении сродства при высоких концентрациях антигена.
