Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Проверка свежеприготовленного меченого лиганда методом электрофореза в ацетате целлюлозы
1. Устанавливают камеру для электрофореза ка бумаге1) и заполняют ее 0,06 М вероналовым буфером, pH 8,6
2. Готовят полоски кз ацетата целлюлозы (Oxoid Ltd) шкрикой приблизительно 1,5—2,5 см и длиной 12 см; отмечают карандашом лкнию старта на расстояник 2—3 см от катодного конца
3. Пропитывают полоски 0,07 М вероналовым буфером, pH 8,6, слегка отжкмают кх между листами фильтровальной бумагк к помещают в камеру на подложку (подложка должна иметь в длину около 10 см, к концы полосок должны выходить за ее края на 1 см с каждой стороны)
4. При помощи прищепок скрепляют концы полосок с фильтровальной бумагой, концы которой должны быть погружены в буферный раствор
5. Наносят 5—10 мкл реакционной смеск, полученной после иодирования, на лннкю старта прк помощи пастеровской пипетки с тонким кончиком или капилляра
6. Используя стабклкзатор, пропускают втеченке 1 ч постоянный ток из расчета 0,4 мА иа 1 см шкркны полоски
7. Полоскк кзвлекают к сушат
8. Разрезают полоски на фрагменты по 0,5 см каждый, отступив на 1 см за линию старта
9. Каждый фрагмент помещают в лробкрку к определяют содержащуюся
в нем радиоактивность при помощк v-счетчкка —
10. Полученные результаты выражают в виде графика, откладывая вдоль оси абсцисс расстояние от линии старта, а вдоль оси ордкнат — чксло импульсов. Как правило, получают два пкка, одни нз которых, расположенный блкже к лкини старта, содержит иодированный белок, а другой, расположенный дальше от лкнии старта, — несвязавшкйся иодид. Рассчктывают выход по способу, указанному в табл. 3.4 и на рис. 3.12
Замечание: Сила тока и длительность его пропускания могут варьировать в зависимости от используемого аппарата. Оптимальные параыетры ыогут быть установлены только методом проб и ошибок.
I) В настоящее время имеетси большое число различных аппаратов для электрофореза. Для описываемого метода очень удобна каыера «Кона», которую вместе с блоком электропитания поставляет фирма Shandon Scientific.
ления применяли метод хроматоэлектрофореза, впервые описанный в работе Берсона и др. (Berson et al., 1956), однако в последнее время этот метод вытеснен другими методами.
Среди неэлектрофоретических методов контроля наиболее быстрым, простым и применимым к большинству иодированных пептидов является своеобразная модификация метода бумажной хроматографии (Orskov, 1967). После иодирования порцию реакционной смеси наносят на узкую полоску бумаги, один конец которой погружают в 10%-ный раствор трихлор-уксусной кислоты. По мере продвижения фронта раствора по полоске иодированный белок будет осаждаться и оставаться на старте. Свободный иодид и поврежденные молекулы небольшого размера, например иодтирозин и иодированные пеп-
Злюат, лгл
Рис. 3.12. Теоретический пример, иллюстрирующий способ расчета выхода иодирован* иого белка после хроматографирования. 20 импульсов приходится иа пик белка н
20
б импульсов—на пик иодида. Таким образом, выход составляет 20 + 5 ^ *°°* или
Общий объем, соответствующий белковому оику, равен 40 мл; если считать, что исход* вое количество белка» подвергшегося иодированию» составляло 10 мкг» то концентрация меченого белка в объединенной фракции будет равна 0,25 мкг/мл.
тиды, при этом не будут осаждаться и, перемещаясь с фронтом растворителя, будут четко отделяться от меченого белка.
Выход (процент включения изотопа в меченый белок, как поврежденный, так и неповрежденный) можно довольно просто рассчитать на основании данных, полученных при отделении любым методом иодированного пептида от свободного иодида. Пример такого расчета приведен на рис. 3.12. Удельную радиоактивность можно рассчитать как функцию выхода, а также исходных количеств изотопа и немеченого белка. Концентрацию меченого белка можно определить несколькими способами, простейший из которых показан на рис. 3.12. Ее можно также рассчитать, исходя из удельной радиоактивности при условии, если известно соотношение между числом импульсов и концентрацией меченого белка, т. е. эффективность счета; такой расчет является хорошей проверкой какого-нибудь из более простых способов определения концентрации меченого белка.
Хотя расчет выхода, удельной радиоактивности и концентрации меченого лиганда относительно прост, тем не менее целесообразно сделать некоторые замечания. На разных этапах метода анализа может иметь место потеря значительной
части радиоактивности, например в результате адсорбции на поверхности пипеток и реакционных колб, а также материала, используемого при очистке. Потери могут достигать 50%. В какой-то степени эти потери можно оценить, определив радиоактивность, оставшуюся в соответствующих сосудах, после их использования. Однако, если не считать пипетки, при помощи которой производится разбавление изотопа, судить о том, в виде какого соединения метка адсорбировалась, довольно трудно, так как в реакционных сосудах и в разделительных системах она может адсорбироваться в форме смесей свободного иодида и меченого пептида в соотношениях, сильно отличающихся от их соотношения в конечном препарате. Это обстоятельство-позволяет объяснить, почему определение величины выхода двумя разными методами (гель-фильтрация и электрофорез в ацетате целлюлозы) может давать разные результаты. Еще одна проблема, возникающая в связи с методами, используемыми для отделения неповрежденного меченого белка от поврежденного, определяется тем, что при расчете удельной радиоактивности и концентрации неповрежденного белка исходят из предположения, согласно которому степень иодирования неповрежденного и поврежденного белка одинакова. Однако это предположение может оказаться неправильным, поскольку небольшой пик радиоактивности может соответствовать очень большому количеству белка, на одну молекулу которого приходится сравнительно мало атомов иода.
