Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 31

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 100 >> Следующая

8) Электрофорез. Метод электрофореза широко применяется для проверки чистоты меченых пептидов (см. разд. 3.7.5), но редко используется для их очистки. Причина заключается в том, что при электрофорезе на бумаге или ацетате целлюлозы можно наносить очень небольшие количества вещества; в противном случае соседние фракции будут перекрываться. При электрофорезе же в крахмальном или полиакриламидном геле можно наносить большие количества, но эти варианты электрофоретического метода довольно трудоемки. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле была проведена очистка 1311-инсулина, причем была показана возможность его разделения по степени иодирования (Berson, Yalow, 1966). Метод представляет значительный интерес с точки зрения его возможностей, однако практического применения еще не получил.
9) Иммунопреципитация. По определению неповрежденный меченый лиганд должен сохранять способность реагировать со связывающим агентом. Поэтому представляется логичным использовать эту способность в качестве критерия при его очистке. В принципе, например, можно было бы извлечь меченый лиганд из исходной реакционной смеси при помощи иммобилизованных антител, а затем провести соответствующее промывание и элюцию. На практике, однако, этот прием используется редко, что связано, по-видимому, с необходимостью относительно больших количеств иммобилизованных антител, а следовательно, больших объемов антисыворотки. Аналогичный прием используется, однако, в иммунорадиомет-рнческом анализе (Miles, Hales, 1968); в этом случае иодированию подвергают очищенные антитела, связанные с твердофазным антигеном, а затем удаляют все нежелательные компоненты путем многократного промывания твердой фазы.
Как уже отмечалось, все операции по приготовлению и очистке иодированного пептида должны занимать не более одного рабочего дня, поскольку при комнатной температуре меченый лиганд разрушается быстрее, чем при низкой температуре. Хранить меченый лиганд следует в тех же условиях, что и стандартные растворы (см. разд. 2.6). В частности, замороженный раствор меченого лиганда рекомендуется хранить в виде аликвот, с тем чтобы его не приходилось замораживать и размораживать более одного раза. Иодированные радиоактивные препараты следует держать в специально предназначенных для этой цели морозильниках или холодильниках, по возможности удаленных от рабочих мест и счетчиков.
В связи с возможностью постепенного повреждения меченого антигена некоторые исследователи подвергают каждую его порцию после размораживания повторной хроматографи-
ческой очистке. Этот прием, несомненно, полезен, однако при обычных анализах отнимает слишком много времени, которое полезнее было бы, вероятно, использовать для приготовления более стабильных препаратов меченого лиганда.
3.7.5. Химический контроль меченого лиганда
Свежеприготовленный препарат меченого лиганда должен быть подвергнут тщательной проверке как при помощи химических методов, так и по характеру его поведения в системе, применяемой для анализа. С помощью химических методов определяют следующие три параметра процесса иодирования: выход, удельную радиоактивность меченого лиганда и абсолютную его концентрацию. Под выходом имеется в виду процент включения изотопа в меченый пептид; при расчете выхода обычно не учитывается соотношение поврежденной и неповрежденной форм пептида. Удельная радиоактивность меченого лиганда означает радиоактивность, приходящуюся на единицу массы или на моль лиганда (например, мКи/мкг); и в этом случае также практически не проводят разграничения между поврежденным и неповрежденным меченым лигандом. Концентрация меченого лиганда означает просто его массу в единице объема. При всей важности этого показателя для целей анализа, к сожалению, очень часто его не определяют и вместо концентрации неповрежденного меченого лиганда просто пользуются указанным поставщиком числом импульсов. В тех случаях, когда процентное содержание поврежденного меченого лиганда оказывается высоким, следует при расчете концентрации вводить соответствующие поправки, с тем чтобы величина концентрации относилась только к неповрежденному меченому лиганду.
Все три указанных параметра рассчитываются йа основании данных, полученных при разделении компонентов исходной реакционной смеси с помощью какого-нибудь физико-химического метода. При этом применяются по существу те же методы, которые используются при очистке (см. разд. 3.7.4). В самом деле, выход, удельную радиоактивность и концентрацию меченого лиганда часто можно рассчитать с помощью детального анализа результатов очистки. Однако все же принято проводить после иодирования дополнительный анализ (чаще всего методом электрофореза), чтобы можно было сравнить качество меченого лиганда до и после очистки.
Простой электрофорез на полосках из ацетата целлюлозы (см. табл. 3.5) позволяет отделить основную массу иодированных пептидов от свободного иодида, а также отделить неповрежденные компоненты от поврежденных. Чаще всего, пожалуй, в области радиоиммунологического анализа для разде-
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed