Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 28

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 22 23 24 25 26 27 < 28 > 29 30 31 32 33 34 .. 100 >> Следующая

ными молекулами будут определяться N-концевые фрагменты и их невозможно будет отличить от интактных молекул.
Существуют три метода сравнения меченого лиганда с немеченым. При первом и самом простом методе иодированное соединение сравнивают с таким же соединением, несущим внутреннюю метку, например 3Н; возможность подобного сравнения зависит от доступности соединения с внутренней меткой. Более широко применяется второй способ, предложенный Хантером (Hunter, 1971). Заготавливают две серии пробирок, содержащих фиксированные количества антител и метки; в один ряд пробирок добавляют серийные разведения немеченого лиганда, а в другой — такие же количества меченого лиганда. Каждая соответствующая пара пробирок содержит, таким образом, одно и то же общее количество лиганда, но в первом случае присутствуют как меченый, так и немеченый лиганд, а во втором — только меченый лиганд. Если метка не повреждена, то в пробирках, содержащих одинаковое общее количество лиганда, процент связывания должен быть одинаковым и кривые, полученные для серийных разведений, должны совпадать. Третий метод основан на сравнении физикохимических свойств меченого и немеченого лиганда, хотя, как уже отмечалось выше, такое сравнение не всегда дает представление о том, как они будут себя вести по отношению к связывающему агенту.
2) Химическое повреждение. Повреждение пептида могут вызывать реагенты, присутствующие в реакционной смеси; чаще всего такие повреждения обусловлены окислением или восстановлением лиганда. Повреждающее действие восстанавливающего агента легко может быть проиллюстрировано на примере вазопрессина. При восстайовлении дисульфидного мостика этого пептида, приводящем к разрыву . кольцевой структуры* молекула полностью утрачивает способность
/
$>, ~о
реагировать с определенными антисыворотками. Химические повреждения могут вызываться и другими, менее специфическими факторами, например присутствующими в препарате изотопа неидентифицированными примесями или характерной для пептидов нестабильностью в разбавленных растворах в отсутствие белка-носителя.
3) Внутреннее облучение. Излучение, связанное с распадом радиоактивных атомов иода, может вызывать разрушение молекул пептида, к которым . ч I ! . присоединены эти атомы.
125, ^ 125, Кроме того, в водном
— растворе под действием
- у излучения могут образо-
/ J-1‘ < “¦ ............—I Т вываться свободные ра-
дикалы, которые будут вызывать повреждение других молекул пептида, х присутствующих в этом
11 растворе. Очевидно, что с увеличением концентра-иии пептида вероятность
|°рЙагм^пЛоЫв1,е^Ги21,!Р1ТТе^особиТрТ Повреждения будет ВОЗ-гяровать с антителами. расТаТЬ. С Практической
точки зрения, в разбавленных растворах, в которых обычно хранятся и используются меченые пептиды, внутреннее облучение вряд ли может вызывать серьезные повреждения. Однако, если в процессе иодирования все реагенты присутствуют в высоких концентрациях, оно может оказывать заметное повреждающее действие.
4) «Катастрофа распада» (Yalow, Berson, 1968). Этот тер-> мин характеризует ситуацию, при которой распад присоединенного к молекуле пептида радиоактивного атома иода вызывает разрушение другой молекулы пептида, с которой связан еще не распавшийся радиоактивный атом иода (рис. 3.8). В результате последний оказывается связанным с фрагментом молекулы пептида, который не способен реагировать со связывающим агентом. В то же время этот фрагмент остается все еще меченым и поэтому при анализе фигурирует в качестве поврежденной метки. Этот тип повреждения наблюдается только в тех случаях, когда молекула пептида содержит по меньшей мере два атома радиоактивного иода. Известно, что повреждения в процессе хранения в случае таких меченых лигандов действительно наступают значительно быстрее, чем в случае немеченых лигандов, что следует отнести в основном за счет внутреннего облучения и «катастрофы распада». Как уже отмечалось, при количественном определении лишь в исключительных случаях требуется, чтобы лиганд обладал бо*
лее высокой удельной радиоактивностью, чем та, которую обеспечивает введение в молекулу лиганда одного атома радиоактивного иода. Из сказанного следует, что по возможности следует избегать более высокой степени замещения.
5) Повреждение во время инкубации. В данном случае имеется в виду возможность постепенного разрушения меченого лиганда в процессе анализа под действием присутствующих в реакционной смеси повреждающих агентов.
Разрушение меченого лиганда легко может привести к артефактам. Допустим, что в результате повреждения указанного типа реакционная способность меченого лиганда уменьшается вдвое. В этом случае конечный результат анализа получится таким, каким бы он был, если бы общее связывание было вдвое меньшим, чем оно есть на самом деле.
Очевидно, что если не вводят поправку на повреждение лиганда, то полученный результат можно принять за истинную концентрацию немеченого лиганда. Примеры, иллюстрирующие такого рода ситуации, а также возможные пути их предотвращения рассмотрены в разд. 9.3.3.
Предыдущая << 1 .. 22 23 24 25 26 27 < 28 > 29 30 31 32 33 34 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed