Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 26

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 100 >> Следующая

Рис 3.6. Схематическое изображение ситуации, которая может возникнуть при опосредованном введении метки в небольшие молекулы (гаптены). Антисыворотка будет содержать популяции антител, одни из которых будут специфичны по отношению к белку-носнтелю (Л), другие — к гаптену {Б) и третьи — к участку (5), связывающему белок н гаптен. Если в метке присутствует такой же связывающий участок, то оиа будет образовывать прочный комплекс с антителами, специфичными к этому участку, и не будет вытесняться из иммунного комплекса чистым антигеном (т. е. стандартом или эндогенным веществом).
Метод имеет два недостатка: 1) метка, вводимая в качестве заместителя, значительно превышает по размеру атом иода, в связи с чем могут иметь место изменения физико-химических свойств меченого пептида; 2) в случае гаптенов возможна ситуация, при которой метка будет хорошо связываться с антителом, но не будет вытесняться немеченым гаптеном; это объясняется присутствием в антисыворотке большого набора антител, обладающих высоким сродством по отношению к участку, связывающему гаптен с белком-носителем при наличии точно такого же связывающего участка между гаптеном и меченой молекулой (рис. 3.6).
3.7.2. Практические аспекты иодирования
Описание иодирования типичного пептида при помощи хлорамина Т приводится в таблице 3.3. Следует подчеркнуть, что хотя точные условия иодирования того или иного вещества могут отличаться от описанных, тем не менее можно сформулировать некоторые общие правила.
1) Выбор изотопа. В случае иода приходится выбирать между изотопами 1251 и 1311. В настоящее время предпочтение отдается изотопу 1251 по следующим причинам: а) период полураспада у 1251 больше, чем у 1311 (60 дней против 8 дней), и, следовательно, срок годности лиганда, меченного этим изотопом, в принципе больше; б) эффективность счета в обычно используемом сцинтилляционном кристалле, имеющем форму
3 Т. Чарл
Приготовление иодированного белка (плацентарного лактогеиа человека) для радиоиммуиологического анализа
Буфер для разведения: 0,05 М фосфатный буфер, pH 7,4, не содержащий белка
1. В небольшом сосудике конической формы растворяют очищенный ПЛЧ (50 мкг) в 0,02 мл буфера. Удобно заранее заготавливать для иодирования такие порции ПЛЧ, для чего аликвоты раствора разливают в серию сосудиков и замораживают
2. Добавляют в сосудик 2 мКи Na,z5I без носителя (объем првблизитель-но 0,02 мл), полученного из Radiochemical Centre, Amersham, кат. № IMC30 или от какой-либо другой фирмы
3. Добавляют в сосудик хлорамин Т (10 мкг) в 0,02 мл буферного раствора. Раствор хлорамина Т следует готовить непосредственно перед проведением иодирования
4. Интенсивно, но недолго перемешивают смесь (в течение 10—15 с) легким постукиванием пальца; необходимо избегать разбрызгивания
5. Добавляют в сосудик метабисульфит (20 мкг), растворенный в 0,02 мл буфера, и перемешивают '
6. Добавляют 0,5 мл буферного раствора, содержащего 1 мг сывороточного альбумина быка
7. Осторожно наносят смесь на колонку (1 X 15 см), заполненную сефа-дексом G-75, которая предварительно промыта буферным раствором, содержащим БСА
8. Элюируют буфером, содержащим 2 мг/мл БСА. В маленькие пробирки собирают фракции по 0,5 мл
9. Проверяют меченый белок по методу, описанному в табл. 3.4
10. Хранят меченый белок в виде аликвот в закрытых ампулах при глубоком замораживании
Примечания. Возможно много модификаций описанного метода, в частности ¦различные соотношения белка и метки. Следует, однако, отметить ряд общих положений: а) для поддержания высоких концентраций реагентов объемы должны быть как можно меньшими; б) количество хлорамина Т должно быть минимальным; в) прп 'данном методе иодирования колонки с сефадексом могут быть сравнительно иеболь-шимп, поскольку при гель-фнл»трации получают одни главный пик белка и пнк йодида. Общее время элюцин составляет в этом случае всего 30 мни, в связи с чем фракции можно собирать вручную. Однако в тех случаях, когда белковая фракция облацает значительной гетерогенностью, приходится исиользовать колонки большего равмера и соответственно увеличивать время элюции.
колодца диаметром порядка 5 см, у 1251 выше, чем у 18Ч; в) от* носительное содержание изотопа [т. е. отношение числа радиоактивных атомов (1251 или 1311) к числу нерадиоактивиых атомов (1271)] у существующих препаратов, меченных изотопом 1251, больше, чем у препаратов, меченных изотопом 1311 (100% против 20%). Последнее обстоятельство в сочетании с более высокой эффективностью счета приводит к тому, что изотоп 1251 дает в два раза больше импульсов (в расчете иа один атом), чём изотоп 1311, хотя для последнего характерен более короткий период полураспада; г) \-лучи, испускаемые изотопом 1251, обладают меиьшей проникающей способностью, чем Y-лучи, испускаемые изотопом ш1, в связи с чем 1251 создает меньшую опасность облучения и меньше трудностей
как источник внешнего фонового излучения. Однако работать с 1251 все равно следует так, как если бы он был источником сильного излучения и представлял опасность для здоровья.
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed