Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
жидкость), выбирают, как правило, менее объемную форму лиганда, которой чаще всего является связанная форма.
Перечень фирм, производящих оборудование для измерения радиоактивности и, в частности, счетчики, приведен в Приложении I.
3.5. Основные характеристики меченего лиганда
Поскольку метка нужна лишь для того, чтобы с ее помощью можно было определить содержание в системе свободного и связанного лиганда, ясно, что меченый лиганд по возможности должен не отличаться по своему поведению от немеченого лиганда. В настоящем контексте под словом «поведение» имеется в виду только способность лиганда связываться со связывающим агентом. Другие свойства меченого лиганда также могут иметь определенное практическое значение, однако они не должны влиять на основные характеристики аналитической системы. Так, например, когда метят изотопом иода такой сравнительно небольшой пептид, как вазопрессин, физико-химические свойства последнего заметно меняются, его молекулярный вес, в частности, увеличивается почти на 12%. Однако при раДиоиммунологическом анализе такой меченый пептидный гормон будет вести себя в системе так же, как и немеченый гормон. В то же время небольшие изменения молекулы пептида, которые трудно обнаружить с помощью большинства физико-химических методов, могут резко изменять его способность связываться с антителом; примером может служить окисление метиоиинового остатка АКТГ. Существует только один обязательный критерий для свойств меченого лиганда — в системе, применяемой для анализа, он должен вести себя так же, как немеченый лиганд.
Уже из самого определения меченого лиганда следует, что он должен хоть чем-то отличаться от немеченого лиганда. Как указывалось выше, эти отличия могут быть связаны с самим присутствием метки в молекуле. Более важные с практической точки зрения отличия могут быть вызваны либо изменениями самой молекулы в процессе введения метки, либо внесенными при этой операции примесями. Те изменения, которые сопровождают введение метки в лиганд и влияют на его способность связываться с субстратом, мы будем в дальнейшем называть «повреждением».
Любой меченый лиганд (или какую-то его часть) следует считать поврежденным, если по сравнению с немеченым лигандом он обладает меиыним сродством к связывающему агенту; причины, вызывающие повреждение лиганда в результате введения в него метки, будут рассмотрены в разд. 3.7.3.
3.6. Приготовление меченых лигандов
Все меченые лиганды можно разделить иа две группы: одни из них содержат внутреннюю метку, а другие искусственно введенную внешнюю метку. В случае внутренней метки присутствующий в молекуле лиганда атом какого-нибудь элемента замещается радиоактивным изотопом этого же элемента (иапример, 14С вместо 12С или 3Н вместо 'Н). Лиганд, содержащий внутреннюю метку, химически идентичен немеченому лиганду; однако в действительности идентичность не всегда имеет место. В случае внешней метки один или несколько атомов в молекуле лиганда замещаются атомами радиоактивного изотопа другого элемента (иапример, изотопами 12Б1 или 13Ч); для того чтобы метка была прочной, она должна быть соединена с молекулой лиганда ковалентной связью. Как это следует из определения, лиганд, содержащий внешнюю метку, химически неидентичен немеченому лиганду, хотя по своему поведению они практически идентичны.
Введение внутренней метки используется обычно в случае небольших молекул, таких, как стероидные гормоны или лекарственные препараты. Такие соединения, как правило, производятся в промышленном масштабе, и мы не будем подробно останавливаться на технике их получения. Отметим только, что существуют следующие четыре основных метода внутреннего маркирования:
1) Бомбардировка соединения нейтронами в атомном реакторе. Обычно к этому методу редко прибегают, поскольку он не обладает избирательностью (т. е. может вызывать изменения многих атомов с образованием самых разных изотопных форм); кроме того, бомбардировка нейтронами может, по-видимому, приводить к разрушению молекул.
2) Химический синтез. Молекулу синтезируют из более простых молекул или элементов, из которых один или несколько находятся в форме радиоактивного изотопа. Такой подход применяется в случае небольших пептидных гормонов; примером может служить синтез вазопрессина из составляющих его аминокислот с применением 3Н-тирозииа.
3) Биологический синтез. Молекула синтезируется в биологической системе in vivo или in vitro из радиоактивных предшественников; в качестве примера можно привести синтез простагландина F2a из меченной тритием арахидоновой кислоты.
4) Реакции изотопного обмена. Среди'методов этого типа наиболее известен метод ВиЛцбаха, который состоит в том, что вещество, предназначенное для маркировки, распределяют по стенкам сосуда и выдерживают в атмосфере газообразного трития (3Н) при комнатной температуре в течение недели.
Процесс может быть значительно ускорен, если подвергать сосуд с веществом внешнему облучению. Меченое вещество отделяют от свободного трития и подвергают тщательной очистке для удаления поврежденных молекул путем перекристаллизации, хроматографирования и т.п. Метод Вилцбаха позволяет получить меченые лиганды с высокой удельной радиоактивностью (до 100 мКи/г), однако он не гарантирует равномерного распределения метки и не обеспечивает специфического ее включения в какой-нибудь определенный участок молекулы.
