Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 19

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 100 >> Следующая

В тайл. 2.1 даны некоторые рекомендации по приготовлению стандартов, предназначенных для использования их в радиоиммуноЛогическом анализе, а в табл. 2.2 — по приготовлению свободной от гормонов сыворотки, предназначенной
Таблица 2.2
Приготовление свободной от лиганда сыворотки, предназначенной для разбавления стандартов
Для многих природных соединений, не обладающих нидовой специфичностью, сравнительно трудно получить сыворотку, не содержащую лиганда. В случае небольших молекул, таких, как, например, кортизол или тироксин, такую сыворотку можно получить путем ее обработки сильным адсорбентом, иапример активированным углем. Все стадии такой обработки следует проводить при низкой температуре
1. К 100 мл плазмы или сыворотки добавляют 10 г не подвергнутого предварительной промыьке сухого активированного угля
2. Перемешивают смесь в течение ночн при помощи магнитной нлн обычной вертикальной мешалки
3. Осаждают основную массу активированного угля путем центрифугирования в течение 1 ч при 10 000 g или более
4. Для удаления остатков активированного угля пропускают надосадочпувд жидкость через серию миллипоровых фильтров (например, 7, 5, 2 и
0,22 мкм)
Полноту экстракции можно проверить путем добавления небольших количеств меченого вещества, например тироксйна, меченного изотопом ш1. Очень важно, чтобы остатки активированного угля были полностью удалены, поскольку даже следовые количества могут мешать анализу.
для использования ее в качестве растворителя при приготовлении стандартов. Рекомендации, касающиеся приготовления растворителя, имеют существенное значение в таких случаях, как, например, определение тироксина, когда природный источник сыворотки, свободной от гормона, является труднодоступным. Некоторые дополнительные вопросы, касающиеся Стандартов, рассматриваются в разд. 10.2.1.4,
2.6. Хранение материалов
В этом разделе рассмотрены некоторые проблемы, относящиеся к хранению реагентов, применяемых в методе связывания: стандартов, связывающих агентов, меченых субстратов и анализируемых образцов. Число возможных реагентов огромно, начиная от водных растворов лекарственных препаратов, способных сохраняться при комнатной - температуре практически неограниченно долго, и кончая небольшими пептидными гормонами плазмы, которые могут разрушаться всего за несколько часов. Несмотря на столь значительное многообразие, можно все же сделать некоторые общие замечания. Большинство веществ биологического происхождения при низкой температуре более стабильны, чем при комнатной, и поэтому их обычно хранят в замороженном состоянии. По вопросу замораживания растворов веществ биологического происхождения необходимо сделать два специальных замечания. Во-первых, замораживание следует проводить очень быстро, в противном случае в процессе охлаждения вещества могут разрушаться. В обычных бытовых холодильниках замораживание происходит медленно, в связи с чем охлаждаемые вещества легко могут разрушаться из-за образования больших кристаллов льда; лучше всего замораживание проводить с самого начала в жидком азоте или в смеси сухого льда с ацетоном, где процесс охлаждения идет намного быстрее и не сопровождается разрушением охлаждаемых веществ. Скорость первоначального замораживания имеет, вероятно, более важное значение, чем температура, при которой впоследствии вещество хранится, в связи с чем часто совершенно напрасно тратятся деньги на приобретение холодильников, дающих очень низкую температуру (ниже —40°С). Второе важное замечание относительно хранения при низкой температуре состоит в том, что повторные циклы замораживания и размораживания чрезвычайно вредны для молекул большинства соединений биологического происхождения. Если тот или иной препарат приходится часто извлекать из холодильника, работающего в режиме глубокого холода, его следует хранить в виде небольших порций, что позволит избежать повторных замораживаний.
Другой аспект хранения — химическое окружение, в котором находится препарат. При хранении белков в растворах их концентрация всегда должна превышать 1 мг/мл. Хорошо известно, например, что разбавленная антисыворотка теряет активность намного быстрее, чем неразбавленная. Если материал недоступен в достаточно высокой концентрации, следует
подумать о добавлении белка-носителя (см. табл. 1.5). Молекулы некоторых веществ биологического происхождения, таких, например, как АКТГ, особенно легко разрушаются при окислении, в связи с чем их лучше хранить в присутствии какого-нибудь восстановителя или в атмосфере, не содержащей кислорода (например, в атмосфере азота). В качестве других факторов, имеющих значение при хранении, следует отметить рн и иоиную силу растворов.
УСЛОВИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ— НАЛИЧИЕ МЕЧЕНОГО ЛИГАНДА
В любом методе связывания большое значение имеет способ измерения относительного содержания свободного и связанного лиганда. Для такого рода измерений в систему вводят небольшое количество высокоочищенного меченого лиганда («метки»). В качестве метки может служить любой связываемый с лигандом маркер, обладающий каким-то характерным признаком, позволяющим проводить точное определение количества лиганда с помощью простых и прямых методов, характеризующихся более высокой чувствительностью по сравнению с методами прямого анализа лиганда как такового. Практически почти всегда в качестве метки используют радиоактивные изотопы, в связи с чем в этой главе будут рассмотрены вопросы, связанные главным образом с применением таких изотопов. Следует однако иметь в виду, что использование радиоактивной метки в принципе не является обязательным признаком методов связывания, в том числе методов иммунологического анализа, составляющего такую важную часть этой группы методов. Наряду с изотопами могут использоваться и другие метки (например, ферменты, флуоресцирующие и люминесцирующие соединения й фаги) при условии, что они отвечают приведенным выше критериям; возможность использования той или иной метки определяется лишь теми практическими ограничениями, от которых зависят чувствительность и воспроизводимость определения лиганда.
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed