Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
I I I -1 I I l_l I I I
0,001 0,01 0,1 1,0 10 100
Концентрация гормона, мпг/мл
A
Рис. 2.1. Калибровочные кривые для гормона роста (СТГ, кривая /), пролактниа (кривая Я) и плацентарного - лактогена человека (кривая III), полученные при использовании антисыворотки к частично очищенному препврату пролвктииа человеке. А. В квчестве меченого лиганав использован СТГ, мечеииыВ изотопом 1251. Б. В квчестве меченого лигаидв использовви пролактин, меченный изотопом |И1. Звметьте, что специфичность этих анализов почти целиком зависит от природы метки. При соответствующем подборе метки сравнительно малоспецифичные антителв могут дать высоко* специфичную систему. (Данные любезно предоставлены д-ром А. С- Мак-Нелли.)
2.3. Доступность чистого лиганда
Мы не имеем возможности обсудить здесь все виды лигандов, которые используются в настоящее время в методах связывания. Вместо этого мы рассмотрим примеры, иллюстрирующие некоторые из возможных проблем. Можно сформулировать, однако, общее положение, сущность которого состоит в следующем: использование лигандов, получаемых синтетическим путем (например, стероидов, небольших пептидных гормонов, лекарственных препаратов), не создает больших трудностей, тогда как при работе с лигандами, получаемыми из природных источников (таких, например, как крупные белковые гормоны, канцероплодные антигены), могут возникать серьезные проблемы. Но, как всегда, нет правил без исключения.
2.3.1. Крупные гермены белкевей природы
При создании первых радиоиммунологических методов для количественного определения инсулина основная трудность заключалась в получении достаточных количеств чистого инсулина человека. Теперь эта проблема решена, поскольку имеется возможность получать как синтетический, так и вы-сокоочищенный природный инсулин. Ниже будет рассмотрен вопрос о том, в какой мере эти препараты соответствуют по своей структуре и биологической активности инсулину, функционирующему в крови человека.
Наиболее серьезные трудности в настоящее время возникают при работе с различными гормонами передней доли гипофиза, и прежде всего это относится к гликопротеидам — ЛГ, ФСГ и ТТГ. Препараты этих гормонов производятся международными фирмами, однако их чистота, если судить по биологической активности в расчете на единицу веса, как правило, меньше, чем у большинства высокоочищенных препаратов, о которых сообщают отдельные исследователи. Более того, некоторые из наиболее широко используемых препаратов гонадотропина получены из мочи женщин в постклимак-терическом периоде, а между тем с иммунохимической точки зрения такой гонадотропин может существенно отличаться от этого же гормона, присутствующего в гипофизе и в крови. Эту проблему пытаются обойти с помощью доступных в настоящее время стандартов, хотя они и не отвечают в полной мере всем необходимым требованиям. Такие стандарты представляют собой либо очищенные гипофизарные материалы (например, 1-й международный стандарт Л Г для радиоиммуно-логического анализа, выделенный из человеческого гипофиза,
MRC 68/40), и аликвоты плазмы женщин в постклимактери* ческом периоде (MRC 69/175).
Детальное описание методов выделения чистых белков читатель найдет в других томах настоящей серии. Для большинства исследователей, имеющих дело с методами связывания, методы очистки белков вряд ли представляют практический интерес, поскольку они обычно требуют специального оборудования и квалифицированного персонала, которые имеются лишь в сравнительно немногих научных центрах. Следует, однако, подчеркнуть одно общее правило: успех очистки зависит как от количества имеющегося в распоряжении исходного материала, так и от содержания в нем нужного вещества. Этот вывод следует из того факта, что при любой последовательности этапов очистки (таких, как гель-фильтрация, ионообменная хроматография, электрофорез) на каждой стадии может теряться около 30—60% нужного материала. Из сказанного следует, что при методе очистки, включающем три стадии, конечный выход составит около 10%; такой низкий выход создает серьезные трудности, если исходный материал содержит 4 мг гормона, но не составляет особой проблемы, если содержание последнего равно 5 кг.
2.3.2. Канцереплодные антигены
Наиболее известными антигенами этой группы являются а-фетопротеин (АФП) и канцероэмбриональный антиген (КЭА). В настоящее время получение высокоочищенного АФП не составляет особого труда, поскольку он содержится в больших количествах в тканях, из которых его выделяют (сыворотка и печень плодов), а последние вполне доступны во многих странах. Хотя КЭА также содержится в больших количествах в тканях, из которых он может быть извлечен (карцинома прямой и толстой кишок), тем не менее его очистка дает менее удовлетворительные результаты и получаемые препараты обладают гетерогенностью, которая,- по-видимому, характерна для всех гликопротеидов, выделяемых нз природных источников. Эта гетерогенность и вытекающая отсюда возможность перекрестных реакций с антигенами, присутствующими в норме, позволяют понять, почему содержание КЭА в крови оказалось менее специфическим показателем злокачественности, чем предполагалось вначале.
