Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Для рационального использования найденной величины К нужна математическая модель. Существует несколько моделей, однако большинство из них требует сложных компьютеров, которые либо недоступны, либо сами по себе отнимают больше времени, чем заняло бы эмпирическое определение целого ряда параметров. Мы рассмотрим здесь простую модель, основанную на законе действующих масс, которая может быть использована любым исследователем, располагающим программируемым калькулятором. Принцип этой модели сводится к тому, что уравнение (1.9)
(Аг — X) (Ат — X) _ (li9)
переводят в форму квадратного уравнения, так что оно легко может быть решено для любого набора введенных величин:
[Аг]. [Ат] - X [Ат] + [Ат] + (1 /К) + Х2 = 0. (1.15)
Ниже приведено решение уравнения (1.15) относительно процента связывания: _____
% связывания = {а —л/а2— b)c, (1.16)
где а = [Ат] + [Аг] + 1//С; 6=4[Аг][Ат] и с = 50/[Аг].
Простые дополнения к программе калькулятора позволяют оценить серйи двукратных разведений связывающего агента или стандарта.
1.10. Некоторые примеры использования модельной системы
В качестве примера применения модельной системы рассмотрим вопрос о выборе ^оптимальной концентрации метки для использования ее в методе связывания. Этот вопрос почти всегда возникает на начальных этапах иалаживания метода анализа; более подробно мы рассмотрим его в разд. 8.2.1. При построении серии кривых, характеризующих разведение связывающего агента, постепенное уменьшение концентрации
Рис. 1.17. Кривые разведения антител» полученные с помощью математической модели (слева; см. разд. 1.9) н при радиоиммуиологыческом определении окситоцниа (справа), Аг* означает меченый антиген. Обратите внимание на то, что в обоих случаях суще* стаует нижанй предел концентрации меченого антигена и дальнейшее уменьшение его концентрации уже не вызывает сдвига в положении кривой.
метки приводит к картине, показанной на рис. 1.17, которая относится как к модельной, так и к реальной системе. При использовании бблыних количеств метки уменьшение ее концентраций приводит к сдвигу кривой вправо, т. е. концентрация связывающего агента, необходимая для связывания 50% метки, постепенно уменьшается. Однако после определенной точки дальнейшее уменьшение концентрации метки уже не вызывает сколько-нибудь значительного сдвига кривой или определяемого титра. Точка, соответствующая такому состоянию, целиком определяется величиной К, характеризующей взаимодействие связывающего агента с лигандом. Этот факт
/9 1—1---1---1----1---1----1__?-------Ll_____L I_______L___I____1___1 >1
/ г 4 3 !6 32 64 63 !25 250 600 /0002000 4000 I
Яемечень/й антиген Яемеченый ял'ситоцин, л г ;'М
Рис. 1.18. Калибровочные кривые, полученные с помощью математической модели (слева; см разд. 1.9) и при радионммуиологическом определении окситоцина (справа). Ч Аг* означает меченый антиген. Обратите внимание на то, что в обеих системах имеете* <?| иижннй предел концентрации меченого антигена» после достижения которого дальней» шее уменьшение концентрации уже не вызывает сдвига калибровочной крнрой.
• .'-d
вовсе не объясняется тем, что при малых концентрациях реагентов, как иногда думают, не достигается равновесие. Важное значение этих наблюдений заключается в том, что та концентрация метки, которая является лимитирующей при построении кривых разведения связывающего агента, оказывается также лимитирующей при построении калибровочной кривой. Иллюстрацией этого положения может служить рис. 1.18. При построении серии калибровочных кривых уменьшение концентрации метки приводит к постепенному сдвигу в левую сторону и к увеличению чувствительности системы (обозначаемому как минимальный предел определения; см. разд. 8.1).
Таблица 1.4
Буферные растворы, используемые в радиоиммунологических методах анализа
В радиоиммунологических методах анализа используется широкий набор различных буферов. За немногими исключениями характер буфера не имеет значения, важно лишь, чтобы ои отвечал следующим требованиям: 1) значение pH ие должно отличаться от нейтрального более чем на 1 единицу, т. е. оно должно быть в пределах 6—8; 2) молярность должна составлять 0,01—0,1 М; 3) буфер не должен содержать микроорганизмов и 4) должен быть свободен от загрязнения лигандом *). Обычно буферный раствор-готовят на дистиллированной или деионизованной воде; в некоторых странах для этой цели можно было бы использовать и водопроводную воду, хотя в более строгих инструкциях и указывается, что электропроводность не должна превышать 1 мкОм. В этой таблице приведен состав трех наиболее широко применяемых буферных растворов. В табл. 1.5 указаны некоторые из наиболее часто применяемых добавок. В некоторых имеющихся в продаже радиоиммунологических наборах для облегчения идеитифякации прилагаются краски, например синяя для антител и желтая дли метки; в коиечиой смеси эти краски дают зеленый цвет. Перед употреблением буфера желательно проверять его pH с помощью рН-метра или индикаторной бумаги с узким интервалом pH (Neutralit, Merck).
