Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Селективная среда -среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии
бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а
лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный
цвет с металлическим оттенком.
К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл
трансдуцирующего фага X dgal в концентрации 10е -107 частиц в 1 мл. Смесь
инкубируют при 37°С в течение 60 мин, после чего приготовляют ряд
десятикратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации
бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с
разведением 10~6 высевают по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо и
равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют
до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют
частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов
(трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток
реципиентного штамма. Так, например, после посева 0,1 мл смеси в
разведении 10~6 на чашке со средой Эндо выросло 138, 170 и 160 бесцветных
колоний реципиентного штамма, на первой
72
и последней чашках -пять и одна колония трансдуктантов красного цвета.
Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:
(5 + 1)-10-ю6 6 13 ю_2
(138+170+160) 10-10е 468
Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы,
содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (рис. 42), Донор -
штамм Е. coii К12 Hfr leu+ Str\ Реципиент - штамм Е. coii К12 F" leu-
Str'. Селективная среда для выделения рекомбинантов - минимальная
глюкозосолевая среда [КН2Р04 -6,5 Г, MgS04- 0,1 г, (NH4)2S04 - 1 г, Са
(N03)2 - 0,001 г, FeS04 - 0,0005 г, глюкоза -2 г, стрептомицин - 200
ЕД/мл, дистиллированная вода - 1 л].
К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры
донора. Посевы инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем смесь разводят
до 10-2 -10-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки
Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве
контроля на ту же среду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые
не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину,
а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного
штамма высевают на селективную среду без
стрептомицина, а культуру реципиентного штамма - на полную среду
(питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных
клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37°С. После подсчета
числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению
количества рекомбинантных клеток к реципиентным. Так, например, после
посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных
культур в разведении 10-2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после
посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения Ю-6 -75 колоний. Таким
образом, частота рекомбинации будет равна:
150 10-100 , 5 . ,05
----------г--------:--Г"" 2,0 10-"
75 10 106 7,5 10е
Постановка опыта конъюгации с целью передачи R-плазми-ды, контролирующей
множественную устойчивость к антибиотикам - стрептомицину (Strr),
тетрациклину (Тсг) и хлорамфени-колу (Cm1). Донор -штамм Е. coii К.12 R+
leu Str1 Tcr Cm' Реципиент-штамм E. coii К12 R- leu+ Strr Tcs Cm*
Селективная среда - минимальная глюкозосолевая среда, со-
73
держащая упомянутые антибиотики в концентрации 50 мкг/мл каждый.
В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора
и реципиента. Смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч и высевают в объеме
0,1 мл на чашку с селективной средой с тремя антибиотиками. На данной
среде вырастут только колонии рекомбинантов (трансконъюган-тов), которые
приобрели резистентность к данным антибиотикам. Отсутствие роста
донорного и реципиентного штаммов на этой среде объясняется тем, что
первый нуждается в лейцине^ а второй чувствителен к антибиотикам. Частоту
формирования трансконъюгантов определяют по отношению количества клеток
трансконъюгантов к числу клеток рецщш-ентного штамма. Так, например, при
высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10-4 на
глюкозосолевую среду с лейцином образовалось 20 колоний, а при высеве 0,1
мл неразведенной смеси -60 колоний трансконъюгантов. Таким образом,
частота формирования трансконъюгантов равна:
60 • ю 6 • 10s
20 • ю • ю4 2 • 10е
- 3,0 • 10-<
Определение колициногенных факторов. Исследуемые культуры Е. coii
засевают уколом в питательный агар в чашке Петри (по 7-8 уколов на одну
чашку). Посевы инкубируют при 37°С в течение суток, после чего на
внутреннюю поверхность крышки чашки помещают кусочек ваты, смоченной
хлороформом, в парах которого погибают бактерии. Затем по поверхности
агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного до 45°С
полужидкого (0,7%) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой
бульонной индикаторной культуры. В качестве таковой подбирается наиболее
чувствительная к данному типу колицина культура E.coli. Через 18-24 ч
