Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
0,5 мл 0,2 н. НСЮ4, и смесь нейтрализуют, добавляя 0,5 мл 0,2 н. КОН
[699].
Сумму сахаров, накопившихся в реакционной смеси после инкубации с
ферментным препаратом, обычно определяют одним из методов
йодометрического титрования, в частности методом Шомодьи - Нельсона [777]
или одной из его модификаций [368]. Для этой цели по 10 мл реакционной
смеси переносят в колбы на 100 мл, добавляют по 10 мл меднощелочного
реактива, перемешивают, накрывают колбы воронками и кипятят на водяной
бане. При этом оксид двухвалентной меди восстанавливается до оксида
одновалентной меди, который окисляется затем свободным йодом.
Необходимыми условиями протекания реакции окисления являются некоторый
избыток йода и слабокислая среда (pH 5). Через 15 мин колбы охлаждают и
постепенно при взбалтывании прибавляют по 5 мл смеси щавелевой и серной
кислот. После полного растворения оксида меди остаток йода титруют 0,01
н. раствором тиосульфата в присутствии 0,5 мл 0,5%-ного раствора
крахмала. Отдельно титруют 10 мл меднощелочного реактива с 5 мл смеси
щавелевой и серной кислот. Активность фермента рассчитывают по формуле
д = у Ц248 - (а~ *)1 (а - *) - I248 - (а - у)1 (а - У)} cpt -1000
где А - активность сахаразы (выражена количеством инвертного сахара (мг),
продуцируемого за 1 ч 1 г мицелия или 1 мл культуральной жидкости); а -
количество 0,01 н. раствора тиосульфата, затраченное при титровании 10 мл
меднощелочного реактива (мл); х, у - соответственно количество 0,01 н.
раствора тиосульфата, затраченное на титрование опытного и контрольного
растворов (мл); Y - объем колбы, в которой производится инкубация (мл); с
- количество раствора, взятое для определения сахаров (мл); р - навеска
мицелия (г) или количество культуральной жидкости (мл), взятое для
определения; t - время действия фермента (ч) [368, 777].
Активность инвертазы в щелочной среде определяют с помощью реактива
Тульчинского перманганатным методом Бертрана [433]. К 6 ми полученного
фильтрата добавляют 6 мл 0,1 н. К2СЮ4. Реакцию окисления сахаров проводят
на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до
комнатной температуры. Окраска раствора с реактивом Тульчинского меняется
от желтой до зеленой. Колориметрирование проводят на ФЭКе при 610 нм.
Стандартную кривую строят после гидролиза сахарозы НС1. Активность
фермента выражают количеством микромолей сахарозы, прогидролизованной
данным количеством фермента за 1 мин. Активность инвертазы определяют
также одним из методов, основанных на применении глюкозооксидазы для
количественного определения образуемой глюкозы. К ним относятся методы, в
которых в качестве хромогенных акцепторов кислорода используют о-толидин,
о-дианизидин (см. раздел V.4). Удобна модификация глюкозооксидазного
метода с использованием 0,1%-ного раствора ферроцианида калия (желтой
кровяной соли). Раствор готовят в день определения или накануне. Хранят в
темной склянке на холоду. Другие реактивы: 0,4 М фосфатный буфер (pH
7,5), глюко-зооксидаза и пероксидаза. Для приготовления рабочего реактива
2,5 мг
200
глюкозооксидазы и 1,5 мг препарата пероксидазы растворяют в 16,6 мл 0,4 М
раствора фосфатного буфера, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и
доводят до метки 0,1%-ным раствором ферроцианида калия. К 0,2 мл
исследуемого раствора, содержащего 10-150 мкг глюкозы, прибавляют 3 мл
рабочего реактива и оставляют при комнатной температуре. После развития
лимонно-желтой окраски оптическую плотность измеряют на спектрофотометре
или ФЭКе при 410 нм против контроля (0,2 мл воды и 3 мл рабочего
реактива). Количество глюкозы в исследуемом растворе определяют по
калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят
растворы, содержащие 100 - 750 мкг глюкозы в 1 мл, что соответствует 20-
150 мкг в пробе [476].
Для определения активности p-фруктофуранозидазы в качестве специфического
субстрата используют раффинозу [132].
V.7.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ САХАРОЗОФОСФОРИЛАЗЫ
(САХАРОЗОГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ)
Состав инкубационной смеси : 0,14 М раствор сахарозы в 0,06 М фосфатном
буфере (pH 7,0), 10%-ный раствор ферментного препарата и 0,05 М раствор
NaF [3]. Время инкубации 2-48 ч в зависимости от степени ферментативной
активности. Реакцию останавливают добавлением ТХУ. Контролем служат
пробы, обработанные ТХУ до инкубации. После фильтрации в пробах
определяют неорганический фосфор. Для этого в колбу с 20 мл 10%-ного
раствора ТХУ вливают 5 мл испытуемой жидкости, перемешивают и немедленно
фильтруют. В мерные пробирки на 10 мл к 3 мл фильтрата добавляют 5 мл
стандартного фосфатного раствора, приливают при энергичном встряхивании
по 1 мл 2,5%-ного молибденовокислого аммония в 3 н. H2S04, затем по 0,4
мл раствора эйконогена, хорошо взбалтывают, доливают до метки и снова
перемешивают. Выдерживают на водяной бане при 37° С 3 мин, охлаждают и
затем колориметрируют при 720 нм с красным светофильтром. Для
приготовления стандартного раствора фосфора 0,3513 г КН2Р04 растворяют в
