Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
перемешивают, закрывают стеклянными пробками и выдерживают 20 мин в
темноте. Затем вводят по 2 мл 2 М раствора серной кислоты (200 г
концентрированной серной кислоты по ГОСТ 4204-66 разбавляют
7*
195
водой до 1 л) и оттитровывают избыток йода 0,05 н. раствором гипосульфита
в присутствии крахмала. Результаты титрования выражают в миллилитрах 0,1
н. раствора гипосульфита. В контрольное определение культуральный
фильтрат вводят после добавления углекислого натрия, непосредственно
перед прибавлением раствора йода.
Для приготовления 0,05 н. раствора гипосульфита 12,5 г
серноватистокислого натрия (ГОСТ 4215-66) растворяют в 1 л
дистиллированной воды, а титр серноватистокислого натрия устанавливают по
двухромовокислому калию (ГОСТ 4220-65).
Для приготовления индикатора - 1%-ного раствора крахмала в насыщенном
растворе хлористого натрия - 1 г крахмала (ГОСТ 10163-62) помещают в
мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 25 мл раствора хлористого натрия,
перемешивают, добавляют еще 25 мл хлористого натрия, помещают колбу в
кипящую водяную баню (при непрерывном перемешивании) до полного
растворения крахмала. Содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 мл
ацетатного буфера (pH 4,7) и доводят объем жидкости до метки раствором
хлористого натрия. Экзополигалактуроназную активность рассчитывают по
формуле ПГА =51,3 alto, где 51,3 - число микроэквивалентов альдегидных
групп, соответствующих 1 мл 0,1 н. раствора йода (или гипосульфита); а -
количество 0,1 н. раствора йода, затраченное на окисление образовавшихся
при пектолизе альдегидных групп, которое находят по разности объемов
раствора гипосульфита, затраченных на титрование опытной и контрольной
проб (мл); t - время пектолиза (мин); о - количество препарата в пробе,
взятое на'титрование культурального фильтрата (г или мг). Для расчета ПГА
могут быть использованы данные, полученные в пределах 20% гидролиза
пектовой кислоты.
Вискозиметрический метод определения активности пектолитиче-ских
ферментов, основанный на гидролизе пектина ферментным препаратом или
культуральной жидкостью с учетом степени расщепления пектина по проценту
снижения вязкости, характеризует активность эндополигалактуроназы,
играющей основную роль в снижении вязкости раствора пектина. За единицу
пектолитической активности, измеряемой по вязкости, принимают количество
фермента, которое в строго определенных условиях при температуре 30° С за
10 мин катализирует гидролиз 1 г пектина со снижением вязкости раствора
на 30%.
V.6.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ РАЗЖИЖАЮЩЕЙ
ЭНДОПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ
Активность эндополигалактуроназы определяют вискозиметриче-ским методом
(ПГС/В) в вискозиметре Оствальда (d = 0,73 мм).
Состав реакционной смеси: 10 мл 1%-ного раствора пектина и 1- 5 мл
культурального фильтрата (разведение подбирают экспериментально). Через
10 мин инкубирования опытной смеси в термостате при 30° С измеряют
вязкость раствора по времени истечения реакционной смеси. В контрольной
пробе фермент инактивируют кипячением. По снижению вязкости (в процентах)
определяют степень гидролиза пектина. Интерполированием находят
количество культурального фильтрата (мл), которое снижает вязкость на
30%. Найденную величину (а) используют для расчета ПГА по вязкости: В =
(tk - -t) • 100l(tk - tb), где В-снижение вязкости (%); /ь-время
истечения контрольного раствора пектина с инактивированным ферментом или
водой (с); t - время истечения опытного раствора пектина с ферментом
после пектолиза (с); tb - время истечения растворителя с инактивиро-
196
ванным ферментом или водой (с); ПГС/В = 0,1/я, где 0,1-постоянная
величина; а - найденное интерполированием количество ферментного
препарата (мг) или культурального фильтрата (мл), снижающее вязкость
раствора пектина на 30%.
V.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ САХАРОЗУ
V.7.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Инвертаза (сахароза) - комплекс ферментов, широко распространенных среди
микроскопических грибов [48], которые осуществляют гидролитическое и
трансферазное расщепление сахарозы и ее произ-
(ЭДЕ>
(c)+(r)
Рис. 90. Предполагаемый путь ферментативного гидролиза сахарозы с
участием инвертазы:
(c)~(r) - сахароза'; 0 - глюкоза; - фруктоза: ДА - Г Ф
активные центры инвертазы: 1 - инвертаза; 2 - гидролиз; 3- активный
комплекс; 4 - Н20; 5 - трансферазное действие; 6 - дисахариды; 7 -
трисахариды; в - тетрасахариды; 9 -• ингибиция субстратом; 10 -
неактивные комплексы; 11 - агрегация субстрата; 12 - скопление молекул
сахарозы, связанных водородными связями (комплекс не образуется)
& "%J
197
водных (рис. 90). При гидролитическом расщеплении сахарозы инвертаза
проявляет сродство к остатку глюкозы, т. е. к а-глюкопира-нозиду, и
поэтому называется а-глюкопиранозидазой (а-глюкозидглю-когидролазой,
К.Ф.3.2.1.20). По этому же принципу фермент способен расщеплять другие
олигосахариды. Исключение составляет раффиноза, а-глюкозил которой
связан, с одной стороны, остатком галактозы, а с другой - остатком
