Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
V.4.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ^-КОМПОНЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗЫ
ПО ОСАХАРИВАНИЮ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГИ [384]
Длительный опыт работы с целлюлозолитическими культурами грибов показал,
что их способность осахаривать фильтровальную бумагу служит показателем
наличия в культурах и препаратах целлюлазы (^-компонента. Кратковременная
инкубация при осахаривании бумаги особенно удобна для оценки растущих
культур грибов.
Последовательность определения. В пробирку помещают 50 мг измельченной
бумаги ("Фильтрак" № 3, ГДР), добавляют 2 мл 0,1 М цитрат-фосфатного
буфера с оптимальным для данной культуры значением pH и 0,5 мл фильтрата
культуральной жидкости или раствора сухого препарата фермента в
концентрации 5 мг/мл. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают в
термостат. После инкубации смеси при оптимальном для данной культуры
значении температуры в течение 1 ч определяют образовавшиеся редуцирующие
сахара.
V.4.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ С^-ФЕРМЕНТОВ [384]
Активность С*-ферментов определяют двумя методами: по степени снижения
вязкости 0,3%-ного раствора Na-КМЦ (степень этерифика-ции 63,8%, степень
полимеризации 495) и по количеству редуцирующих сахаров, образующихся в
результате гидролиза указанного субстрата.
V.4.3.5. ОСАХАРИВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ С^ ФЕРМЕНТОВ [384]
Последовательность определения. К 1 мл 1%-ного раствора Na-КМЦ в цитрат-
фосфатном буфере при оптимальных условиях приливают 1 мл ферментного
раствора или культурального фильтрата и инкубируют в течение 30 мин.
Затем определяют количество редуцирующих сахаров в 1 мл реакционной
смеси.
За единицу активности фермента принимают количество редуцирующих сахаров
(глюкозы) в миллиграммах, образовавшихся при действии 1 мл неразведенного
фильтрата культуральной жидкости на соответствующие субстраты в условиях
реакции.
185
V.4.3.6. ЭНДОГЛЮКАНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ СХ-ФЕРМЕНТОВ [384]
Эндоглюканазную активность определяют по снижению вязкости 0,3%-ного
раствора Na-КМЦ (степень замещения 0,63, степень полимеризации 495).
Вязкость определяют в вискозиметре Оствальда по времени истечения 5 мл
0,3%-ного раствора Na-КМЦ, к которому добавляют 0,7 мл культурального
фильтрата и 0,3 мл цитрат-фосфатного буфера в оптимальных условиях.
Разжижающую активность фермента рассчитывают по формуле (Т - Т0) •
100%/Т, где Т0 - время истечения опытного раствора (с); Т - время
истечения контрольного раствора (с), в котором ферменты предварительно
инактивировались кипячением. Время инкубации 3 мин. Активность С*-
фермента выражают в процентах падения вязкости раствора Na-КМЦ под
действием фермента [384].
V.4.3.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Р-ГЛЮКОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ [384]
р-Глюкозидазную активность определяют путем измерения увеличения
содержания редуцирующих сахаров, образовавшихся под действием ферментов
на целлобиозу либо /г-нитрофенил-Р-глюкозид [384].
Состав реакционной смеси: в пробирку наливают 1 мл 0,05%-ного раствора
целлобиозы в цитрат-фосфатном буфере при оптимальных условиях реакции, 1
мл ферментного раствора или культурального фильтрата и инкубируют в
течение 30 мин. После инкубации определяют количество редуцирующих
сахаров в 1 мл реакционной смеси.
У.4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ
У.4.4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕДУЦИРУЮЩИХ САХАРОВ МЕТОДОМ
ШОМОДЬИ - НЕЛЬСОНА [777]
Приборы и реактивы. Универсальный термостат (например, У 10, ГДР);
фотоэлектроколориметр (ФЭК-56); ацетат натрия (чда); уксусная кислота
(чда); бикарбонат натрия (чда); карбонат натрия (безводный; чда);
калийнатрийтартрат (C4H406KNa • 4Н20; чда); сульфат натрия безводный
(чда); молибдат аммония ((NH4)6Mo7024 • 4Н20; ч); концентрированная
серная кислота (хч); арсенат натрия (Na2HAs04 X X 7Н20). Для определения
редуцирующих сахаров используют реактивы Шомодьи и Нельсона [777].
Реактив Шомодьи готовят последовательным растворением в 250 мл воды 24 г
безводного карбоната натрия, 12 г калийнатрийтартрата, 40 мл 10%-ного
водного раствора сульфата меди, 16 г бикарбоната натрия и раствора
сульфата натрия (18 г в 500 мл воды, не содержащей С02). Объем раствора
доводят до 1 л. Этот реактив хранят в темной склянке.
Реактив Нельсона готовят последовательным растворением в 400 мл воды 25 г
молибдата аммония, 21 мл концентрированной серной кислоты и раствора
арсената натрия (3 г в 25 мл воды). Полученный реактив доводят до 500 мл
и выдерживают 2 сут при 37° С.
Последовательность определения. 50 мг хлопкового волокна хорошо смачивают
в пробирке 2 мл 0,1 М ацетатного буфера и 1 мл раствора фермента или
культурального фильтрата.Так как в препарате фермента могут содержаться
редуцирующие вещества, готовят также контрольную смесь, не содержащую
субстрата. Опытную и контрольную реакционные смеси инкубирукрт при 40° С
в течение 1 ч, после чего опреде-
186
ляют содержание редуцирующих сахаров [445]. Для этого к 1 мл контрольной
и опытной реакционных смесей добавляют по 1 мл раствора Шомодьи,
выдерживают в кипящей бане 15 мин, охлаждают и, добавив при перемешивании
