Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
После извлечения хроматограммы из камеры ее высушивают в Вытяжном шкафу в
течение часа и проявляют. Для проявления аль-доз используют: 10 мл 96%-
ного этилового спирта; 0,4 г салициловой кислоты; 0,5 мл ортотолуидина;
для кетоз: 9 мл 96%-ного этилового спирта; 1 мл 1 н. водного раствора
НС1; 0,1 г мочевины. Ватным тампоном проявитель наносят равномерным слоем
на поверхность хроматограммы. Высушивают при комнатной температуре. После
полного высыхания хроматограмму помещают в сушильный шкаф, предварительно
нагретый до 100-105° С, и выдерживают 10 мин. При этой температуре на
хроматограмме проявляются сахара, которые идентифицируют по стандартным
растворам, глюкозе и целлобиозе.
V.4.2.3. ОБРАЗОВАНИЕ ЗОН ПРОСВЕТЛЕНИЯ
НАТРИЙКАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗНОГО АГАРА (Na-КМЦ) [221, 445]
Последовательность определения. Агаризованную среду, состоящую из цитрат-
фосфатного буфера, pH 5,2, с 0,5%-ным раствором Na-КМЦ, разливают в чашки
Петри; на поверхность среды помещают стеклянные цилиндрики размером 0,5 X
1,5, см и вносят в них по 0,5 мл исследуемого фильтрата. Чашки инкубируют
в термостате при температуре 40° С. Зоны просветления измеряют в течение
5 сут, каждые 24 ч.
183
V.4.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛОЯ РАЗЖИЖЕНИЯ ГЕЛЯ Na-КМЦ [221]
Последовательность определения. В пробирки наливают 5%-ный гель Na-КЦМ
высотой 30-40 см со степенью замещения 65,5, приготовленный на цитрат-
фосфатном буфере, pH 5,2. На поверхность геля осторожно наливают 0,5 мл
культурального фильтрата. Инкубируют при температуре 40° С в
ультратермостате. Слой разжижения измеряют в течение 5 сут, каждые 24 ч.
Из перечисленных методов для первичного отбора целлюлозоли-тических
грибов чаще используют два первых. Отобранные целлюлозоразрушающие грибы
исследуют на содержание целлюлозолити-ческих ферментов: Сх-, С*-, р-
глюкозидазы.
Y.4.3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ
Поскольку определения, как правило, выполняют в растворах, содержащих
смесь различных целлюлозолитических ферментов, то Cr, Qr, Р-глюкозидазную
активность комплекса учитывают по их действию на разные субстраты.
При гидролизе целлюлозосодержащих материалов в промышленных условиях
особое внимание уделяют определению солюбилизирующей активности, которую
часто идентифицируют с ^-активностью. Технические методы дают
представление о целлюлозолитической активности, но не указывают на
количественное соотношение отдельных ферментов целлюлозолитического
комплекса. Для более полной оценки целлюлозолитической активности
необходимо определить активность отдельных ферментов целлюлозолитического
комплекса, чтобы выяснить биохимический механизм ферментативного
гидролиза целлюлозы, а также отобрать микроорганизмы, образующие эти
ферменты. Солюбилизация целлюлозы вызывается синергизмом экзо-р-глюка-
назы и эндо-Р-глюканазы [445]. Для определения солюбилизирующей
активности в качестве субстрата используют хлопковое волокно,
микрокристаллическую целлюлозу ("Avicel") или гидроцеллюлозу с
последующим определением редуцирующих сахаров [689], потери массы
субстрата [579] или уменьшения оптимальной плотности целлюлозной
суспензии [607].
У.4.3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ^-ФЕРМЕНТА [384]
Активность С^-фермента определяют по количеству глюкозы, образовавшейся в
реакционной смеси при использовании в качестве субстрата обезжиренного
хлопкового волокна. Обезжиривание хлопкового волокна проводят путем
экстракции этанолом в аппарате Сокс-лета в течение 8 ч, затем этиловым
эфиром, в течение 6 ч, после чего в течение 8 ч его промывают 1%-ным
раствором щелочи в атмосфере азота. Щелочь отмывают сначала горячей
водой, затем 1%-ным раствором уксусной кислоты и холодной водой до
нейтральной реакции. Обезжиренный хлопок (хлопковое волокно) высушивают
на воздухе.
Последовательность определения. В пробирку помещают 3 мг обезжиренного
хлопкового волокна, 1 мл цитрат-фосфатного буфера и 1 мл культурального
фильтрата или раствора фермента, закрывают резиновой пробкой и ставят в
термостат на 24 ч при оптимальных условиях реакции. Затем в реакционной
смеси определяют редуцирующие сахара. Параллельно ставят контрольную
реакционную смесь; 1 мл
184
0,1 М цитрат-фосфатного буфера, I мл дистиллированной воды и З мг
хлопкового волокна. Количество редуцирующих веществ в культуральном
фильтрате или в ферментном препарате рассчитывают по разности их
содержания в опытной и контрольной смесях.
V.4.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛУБИНЫ ОСАХАРИВАНИЯ ХЛОПКА
ПРИ ДЛИТЕЛЬНОЙ ИНКУБАЦИИ [384]
Для окончательной оценки продуцентов и получаемых препаратов целлюлазы
необходимо определить глубину осахаривания хлопкового волокна в течение 3
сут.
Состав реакционной смеси: 3 мг хлопкового волокна; 1 мл 0,1 М цитрат-
фосфатного буфера и 1 мл культурального фильтрата или раствора фермента
при оптимальных условиях. Пробирки с реакционной смесью выдерживают в
термостате 3 сут, после чего определяют образовавшиеся редуцирующие
сахара методом Шомодьи-Нельсона (в процентах от взятого субстрата).
