Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 83

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 77 78 79 80 81 82 < 83 > 84 85 86 87 88 89 .. 279 >> Следующая

экстинкция; 10 - объем окрашенной пробы (мл); 1000-коэффициент для
пересчета из миллилитров в литры; 0,0128 - коэффициент микромолярной
экстинкции; 0,1 - объем раствора пероксидазы (мл); 5 - время инкубации
(мин). Или, если, например, инкубационная смесь содержала 0,2 мл раствора
фермента (2 мкг), интенсивность окраски была такая же (0,20), то
количество единиц активности пероксидазы в 1 мл препарата равно 0,20 • 10
X X 1000/0,0128 • 1000 -2 * 5= 15,6.
V.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ
Метод основан на титрометрическом определении количества разложившейся
перекиси водорода в течение определенного времени [254, 397]. За единицу
активности каталазы принято количество фермента, катализирующее
разложение 1 мкМ Н202 (0,034 мг) за 1 мин.
Посуда: кЬлбочки емкостью 50 мл, пипетки, градуированные на 1, 2 и 3 мл;
мерный цилиндр емкостью 1 л; микробюретка на 5 мл.
Реактивы: 0,01 н. раствор перекиси водорода в 0,006 М фосфатном буфере,
pH 6,8; 5 н. раствор серной кислоты; 10%-ный раствор йодистого калия; 1
%-ный раствор молибдата аммония; 1 %-ный раствор крахмала; 0,01 н.
раствор тиосульфата натрия.
Последовательность определения. В колбочки емкостью 50 мл наливают по 5
мл раствора перекиси водорода в фосфатном буфере и прибавляют по 0,5 мл
разведенной до нужной концентрации культуральной жидкости. Инкубируют 3
мин на льду и затем реакцию останавливают добавлением 2 мл 5 н. раствора
серной кислоты. Далее в колбочки приливают по 2 мл 10%-ного раствора
йодистого калия и по 1-2 капли 1%-ного раствора молибденовокислого
аммония. Через 3 мин оттит-ровывают выделившийся йод 0,01 н. раствором
тиосульфата натрия.
В конце титрования для четкого фиксирования конечной точки процесса
добавляют в качестве индикатора 1-2 капли 1%-ного раствора крахмала.
Контролем служит проба, в которую вместо культуральной жидкости приливают
дистиллированную воду.
Исходя из того что 1 мл 0,01 н. тиосульфата натрия соответствует 0,17 мг
перекиси водорода и зная разницу между его количеством, ушедшим на
титрование контрольной и опытной проб, количество разложенной перекиси
водорода рассчитывают по формуле X = (VK-Уоп)Х X0,17/0,5 • 0,034 • 3
~(Vk- Von) 3,33 Р, где X - активность каталазы в 1 мл исходного раствора;
VK-количество тиосульфата натрия, ушедшего на титрование контрольной
пробы (мл); Коп - количество тиосульфата натрия, ушедшего на титрование
опытной пробы (мл); 0,17 - количество Н202 (мг), соответствующее 1 мл
0,01 н. тиосульфата натрия; 0,034 - количество Н202 (мг), соответствующее
1 мкМ; 0,5 - количество разведенной культуральной жидкости в пробе; 3 -
время инкубации (мин); Р - фактор разведения.
Г78
Для точности анализа разность VK - Vou не должна быть меньше 1,1 и выше
2,3 мл. В первом случае в анализ берут большее количество ферментного
раствора, во втором - его разводят.
Y.3.5. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
Метод основан на титрометрическом определении активности глюкозооксидазы
по количеству перекиси водорода, образующейся в процессе окисления
глюкозы глюкозооксидазой [130, 254]. Активность фермента выражается в
международных манометрических единицах. За единицу глюкозооксидазной
активности принято количество фермента, катализирующее окисление 1 мкМ
глюкозы за 1 мин в оптимальных условиях: температуре 30° С, избытке
кислорода и глюкозы, что сопровождается потреблением 1 мкМ кислорода,
равного 22,4 мкг.
Посуда, приборы: колбочки емкостью 50 мл; пипетки, градуированные на 1 и
5 мл; мерные колбочки емкостью 50 мл; микробюретка на 2-5 мл; аппарат для
встряхивания.
Реактивы: ацетатный буфер с pH 5,8 (в мерную колбочку емкостью 50 мл
вливают 19,5 мл 0,25 М уксуснокислого натрия, 0,5 мл 0,25 М уксусной
кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают); 33%-ный
раствор глюкозы; 10%-ный раствор йодистого калия; 0,01 н. раствор
тиосульфата натрия; 20%-ный раствор серной кислоты; 1%-ный раствор
молибденовокислого аммония; 1%-ный раствор крахмала.
Последовательность определения. В колбочки емкостью 50 мл вливают по 4,5
мл 0,1 М ацетатного буфера с pH 5,8 и 0,5 мл соответствующим образом
разведенной культуральной жидкости. Колбочки устанавливают на аппарат для
встряхивания, быстро добавляют по 0,5 мл 33%-ного раствора глюкозы и
встряхивают 10 мин. Через 10 мин аппарат выключают и реакцию прекращают
прибавлением к смеси 2^мл 20%-ного раствора серной кислоты. Контролем
служит аналогичная смесь, в которую реактивы прибавляют в обратном
порядке: серную кислоту, затем раствор фермента, буфер и глюкозу. Далее в
каждую из колб (контрольную и опытную) добавляют по 1 мл 10%-ного
раствора свежеприготовленного йодистого калия и по одной капле 1%-ного
раствора молибденовокислого аммония (катализатор). Через 3 мин йод,
образовавшийся вследствие реакции между йодистым калием и перекисью
водорода, оттитровывают 0,01 н. раствором тиосульфата натрия (по
индикатору - крахмалу). По разности объемов, затраченных на титрование
Предыдущая << 1 .. 77 78 79 80 81 82 < 83 > 84 85 86 87 88 89 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed