Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
хроматографические методы позволяют быстро выделить относительно чистые
белковые фракции из небольшого количества сложной смеси (подробное
описание метода хроматографии белков на ионообменных смолах см. в разделе
VII. 2., а также в работах [105, 106, 142, 399]).
V.2.3.5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ [219, 421, 725]
Метод основан на специфическом взаимодействии ферментов с субстратом (или
аналогом субстрата), связанным с нерастворимым носителем (например,
агарозой, целлюлозой). Суть его заключается в том, что через колонку,
заполненную специфическим сорбентом, пропускают раствор, содержащий
выделяемый фермент. Последний связывается с лигандом, а посторонние
вещества, в том числе и белки, свободно выходят из колонки. Затем в
соответствующих условиях адсорбированный фермент элюируют с колонки.
Таким образом получают довольно высокоочищенные ферменты. В качестве
примера можно привести фракционирование протосубтилина на ДИФ-
гексаметилендиамин-сефарозе 4В и грамицидин-С-сефарозе 4В; протеаз
животного и микробного происхождения на тозилтриэтилентетрааминсефарозе и
карбобен-заокситриэтилентетрааминсефарозе [148, 219].
V.2.3.6. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ [284, 424, 569]
Один из перспективных методов очистки ферментов, основанный на том, что в
изоэлектрической точке (ИЭТ) суммарный заряд белковой частицы равен нулю
и она не движется в электрическом поле. Для проведения изоэлектрического
фокусирования колонку наполняют смесью амфолинов с различными ИЭТ (pH 3-
10). Под действием электрического поля амфолины распределяются в колонке
соответственно их ИЭТ. В результате образуется градиент pH. Ферменты,
находящиеся в растворе вместе с амфолином, также разделяются под
действием электрического поля, занимая в градиенте pH положение,
соответст-
174
вующее их ИЭТ. Изоэлектрофокусирование целесообразно проводить в
градиенте плотности сахарозы и при температуре 0° С. Оптимальный вариант
чередования приемов фракционирования и очистки определяют
экспериментально для каждого фермента.
V.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИД АЗЫ, КАТАЛАЗЫ, ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
V.3.I. ФЕРМЕНТЫ - АКТИВАТОРЫ КИСЛОРОДА. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Согласно классификации и номенклатуре ферментов, рекомендованных
Международным биохимическим союзом по номенклатуре и классификации
ферментов в 1961 г., ферменты этой группы, как и все ферменты,
катализирующие окислительно-восстановительные реакции, относятся к классу
оксидоредуктаз. Придерживаясь в основном международной номенклатуры, мы
выделяем группу активаторов кислорода, как это делают Б. А. Рубин, М. Е.
Ладыгина [391], поскольку окси-дазы грибов наиболее близки к
растительным.
Функция ферментов данной группы состоит в активировании молекулярного
кислорода
Группа активаторов кислорода, также как и ферментов, активирующих
водород, многочисленна. В зависимости от природы металла, входящего в
состав простетических групп, оксидазы можно разделить на две подгруппы:
железопротеиды (Fe-протеиды) и медьпротеиды (Си-протеиды). Fe-протеиды -
двухкомпонентные каталитические соединения, простетический группой
которых являются Fe-порфирины. Fe-протеиды, соединяясь с кислородом,
образуют окислы: xFe + 02 = = *Fe02, которые передают свой кислород
дыхательному субстрату: 2А + *Fe02 2АО + *Fe. Восстановленное железо
вновь способно служить акцептором кислорода.
Наиболее активной в группе Fe-протеидов является система цито-хромов. К
этой же группе обычно относят каталазу и пероксидазу, которые по ряду
свойств близки к оксидазам, хотя используют для окисления субстратов
кислород перекисей. Представителями Си-про-теидов являются фенолоксидазы
и аскорбинатоксидаза.
Наряду с "классическими" оксидазами, которые используют молекулярный
кислород как акцептор электронов, существуют ферменты, активирующие
молекулярный кислород, т. е. катализирующие внедрение кислорода в
молекулу дыхательного субстрата. Эти ферменты принято называть
оксигеназами, или трансферазами кислорода, поскольку они переносят
кислород непосредственно на субстрат. К этой группе ферментов относят
липоксигеназу, пирокатехазы, оксигеназы триптофана и др.
Наконец, к терминальным оксидазам относят группу ферментов, которые
катализируют перенос водорода (электронов) дыхательного
175
субстрата непосредственно на молекулярный кислород. Эти ферменты называют
аэробными дегидрогеназами и подразделяют на содержащие металл -
ксантиногеназы, нитратредуктазы и не содержащие металл- ксилозооксидазы,
глюкозооксидазу и оксидазы аминокислот.
Пероксидаза катализирует окисление субстрата перекисью водорода. Считают,
что она разлагает перекись водорода с освобождением атомарного кислорода,
который и используется на окисление различных соединений. Наиболее полно
изучены широко распространенные пероксидазы растений. Среди грибов
образование пероксидазы обычно присуще дереворазрушающим базидиомицетам
[680], а также микро-мицетам, особенно выделенным из лесной подстилки
[356]. Образование пероксидазы у грибов зависит от экологических условий.
