Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
пектины, НК, клетчатку, и другие, т. е. на вещества, при растворении
которых образуются растворы, отличающиеся по вязкости от исходных (см.
разделы V.4.3. и V.9.4).
V.1.6.5. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Хроматографические методы с успехом применяют для определения целлюлаз
(по составу сахаров, образующихся в результате расщепления целлюлозы),
протеолитических ферментов (определение степени расщепления белкового
субстрата по составу аминокислот, ди- и полипептидов), декарбоксилаз
аминокислот и других ферментов, под действием которых образуются
вещества, требующие точной идентификации (см. разделы V.4; V.5; VI. 1).
У.1.6.6. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Эти методы основаны на разной способности субстратов и продуктов
ферментативных реакций поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой
областях спектра. Определяя изменения поглощения света, реакционной
смесью, можно количественно оценить течение ферментативной реакции. При
проведении сравнительных исследований изменения скорости реакции
определяют по изменению оптической плотности, а единицы активности
фермента выражают в единицах оптической плотности.
Спектрофотометрический метод применяют также для изучения действия
окислительных ферментов: 1) цитохромов (полосы поглощения восстановленных
форм цитохромов отличны от полос поглощения окисленных); 2) дегидрогеназ
в сочетании с коферментами НАД^ и НАДФ-^ (окисленные и восстановленные
формы этих соединений резко различаются по своим спектрам); 3) протеаз
(по определенному количеству тирозина и триптофана, образующегося при
расщеплении белка) (см. раздел V,9J).
170
V.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ
V.2.I. НЕКОТОРЫЕ ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ
С ФЕРМЕНТАМИ [132, 236, 464]
Ферменты - относительно неустойчивые вещества. При неблагоприятных
условиях они легко денатурируются и инактивируются. Успех работы с
ферментами зависит от соблюдения ряда условий, основными из которых
являются поддержание щадящей температуры и умеренной концентрации
водородных ионов. Выделение многих ферментов осуществляют при температуре
около 0° С и нейтральном значении pH, так как большинство ферментов
инактивируется в растворах с pH ниже 5 или выше 9, хотя из этого правила
имеются исключения. При доведении pH раствора фермента до определенного
значения реагент следует добавлять медленно, давая ему стекать по стенке
сосуда, одновременно энергично перемешивая раствор. Добавлять реагент
следует, если это возможно, при 0° С. Многие ферменты денатурируются на
границе раздела фаз. Поэтому важно избегать образования пены - переливать
раствор фермента из одного сосуда в другой следует по стенке сосуда. По
этой же причине не следует употреблять мешалки, вспенивающие жидкость.
Желательно пользоваться магнитными мешалками.
При фракционировании сульфатом аммония, если соль добавляют в сухом виде,
растворенный в жидкости воздух может "высаливаться" в виде мелких
пузырьков, вызывая денатурацию ферментов. Устранить это явление можно,
добавляя соль в виде насыщенного раствора.
Органические растворители (например, достаточно концентрированные спирты,
ацетон) инактивируют большинство ферментов при комнатной температуре.
Поэтому фракционное осаждение спиртом или ацетоном необходимо проводить
при возможно более низкой температуре, следя за тем, чтобы раствор не
нагревался в результате выделения тепла при смешивании растворителя с
водой.
Выпавшие осадки отделяют фильтрованием или центрифугированием. Последнему
способу обычно отдают предпочтение при наличии центрифуги с охлаждением.
Во многих случаях фермент при выделении и очистке медленно инактивируется
даже в наиболее благоприятных условиях. Поэтому целесообразно очищать
ферменты по возможности быстро, заканчивая выделение в течение 2-3 дней.
Для предотвращения инактивации ферментов при хранении их содержат в
состоянии глубокого охлаждения (если замораживание и оттаивание не влияют
на активность). При этом ферменты остаются стабильными в течение многих
месяцев. Высушивание ферментов в условиях высокого вакуума при низкой
температуре - лиофильная сушка - весьма ценный метод, с помощью которого
можно получить активный растворимый препарат, сохраняющий свои свойства
при комнатной температуре.
Y.2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ [4Г 96, 385, 399]
Универсального метода выделения и очистки ферментов не существует, однако
существуют общие правила, соблюдение которых обязательно. Приступая к
работе по очистке ферментов, в первую очередь необходимо выбрать
количественный тест определения ферментативной активности. Поскольку при
выделении фермента большая часть времени уходит на определение его
активности в различных фракциях,
171
в данном случае скорость определений более важна, чем точность. Например,
в процессе фракционирования и очистки метод определения активности,
требующий 5 мин и допускающий ошибку 10-20%, предпочитают более точному
методу, требующему 30 мин.
После того как подобраны организмы - продуценты определенного фермента и
