Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
оболочки, получаемые при разрушении клеток грибов; 4) органеллы клеток -
протопласты, митохондрии, рибосомы и другие, обычно получаемые путем
дифференциального центрифугирования; 5) растворимые компоненты, в том
числе и высокомолекулярные соединения (НК, белки и др.), остающиеся при
центрифугировании в надосадочной жидкости.
Изучение метаболизма в субклеточных структурах предполагает
предварительное разрушение клеток гифы, выделение клеточных ор-ганелл в
гомогенном и нативном состояниях.
156
IV.6.3.1. МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЙ ГРИБНОЙ КЛЕТКИ
Разрушение грибных клеток представляет значительные трудности в связи с
устойчивостью их оболочек. В микробиологии и других областях биологии
применяют разные методы разрушения клеточной оболочки: ферментативное
переваривание (при получении протопластов), действие ультразвука,
попеременное замораживание и оттаивание, осмотический шок, или
плазмоптис, разрушение мицелия (в гомогенизаторах или путем растирания с
кварцевым или стеклянным песком). Последний метод применяют чаще всего,
хотя он и не всегда обеспечивает высокий процент разрушения клеток.
Механическое разрушение. Применяют для получения гомогенатов, в которых
отдельные компоненты клетки распределены относительно равномерно.
Определенную навеску мицелия растирают на холоду (4-5° С) в определенном
объеме буферного раствора, выбор и концентрация которого устанавливают
экспериментально [447].
Ферментативное разрушение. Для изучения строения и химического состава, а
также для выделения протопластов клеточные оболочки грибов разрушают с
помощью ферментативного гидролиза или лизиса. Продукты различной степени
гидролиза клеточных оболочек анализируют хроматографическими и
химическими методами. Лизис (растворение) клеточных оболочек осуществляют
путем воздействия ферментов, способных последовательно гидролизовать слои
полимера в матрице оболочки. К числу ферментов, используемых для полного
или частичного лизиса клеточной оболочки, относятся а- и Р-глюканазы,
протеазы и пептидазы, хитиназы, гексозаминидазы, целлюлазы, глю-
куронидазы, липазы и др.
При действии комплексных литических ферментов (например, выделенных из
улитки Helix pomatia или из некоторых видов стрептоми-цетов) в гифах
грибов могут образоваться одна или несколько пор, через которые выходят
протопласты. Их размеры меньше, чем у получаемых при лизисе клеточной
оболочки; они способны к регенерации, а также агрегации в более крупные
сферические образования.
Применяя различные комбинации высокоочищенных гидролитических ферментов и
действуя ими в определенной последовательности, изучают особенности
"архитектурного" строения клеточной оболочки, выделяют протопласты и
некоторые органеллы клетки [497].
Протопласты некоторых видов грибов можно выделить и без разрушения
клеточной оболочки - они выходят из верхушечных клеток гиф или конидий,
обычно при росте на жидкой среде. Фильтрованием среды через стерильный
стеклянный фильтр протопласты отделяют от мицелия, а оставшиеся во взвеси
протопласты осаждают центрифугированием. В качестве стабилизаторов
протопластов применяют растворы сахаров или минеральных солей (0,2-1 М).
IV.6.3.2. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ
Для фракционирования субклеточных структур из гомогенатов клеток
используют несколько методов [362].
1. Дифференциальное центрифугирование в растворах сахарозы определенной
концентрации.
2. Разделение субклеточных структур по скорости седиментации в растворах
сахарозы, концентрация которых возрастает от мениска жидкости ко дну
пробирки (дифференциальное центрифугирование в сахарозном градиенте),
Важное значение при этом имеют правильное
157
приготовление градиентных растворов сахарозы с постепенно меняющейся
концентрацией, образующихся пр-и смешении двух основных растворов с
высокой (50%) и низкой (5%) концентрацией; последовательное наслаивание
менее плотных растворов на более плотные. Градиентные растворы сахарозы
готовят в специальных приборах или с помощью пипетки вносят в пробирку
менее плотные растворы известной концентрации на более плотные (например,
вносят последовательно определенные порции 30-, 25-, 20-, 15-, 10%-ных
растворов сахарозы, затем наслаивают гомогенат). Клеточные компоненты
разделяют в градиентных растворах сахарозы путем центрифугирования
гомогенатов.
3. Разделение субклеточных структур в зависимости от их плотности в
растворах возрастающего удельного веса - изоплотностное градиентное
центрифугирование.
4. Разделение субклеточных структур на зоны в зависимости от скорости
седиментации и плотности частиц - зональное центрифугирование.
5. Изоплотностное центрифугирование в растворах сахарозы определенной
плотности, приводящее к флотации или седиментации частиц определенной
плотности.
IV.6.3.3. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Сущность метода заключается в седиментационном разделении клеточных
органелл разных размеров. Разделение проводят в ультрацентрифугах с
