Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
на стерилизованное просо или пшено.
111.3.4.1. ПОДГОТОВКА ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА P. VITALE НА ПРОСЕ
В пробирки 20 X 2 см вносят по 8-10 г чистого сухого проса, закрывают их
ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при давлении в 2 атм (134° С)
в течение 20 мин. Сухое просо стерилизуют двукратно с интервалом в 20-24
ч. После второй стерилизации в пробирки добавляют стерильную
водопроводную воду (60-80% массы проса) и снова стерилизуют. Сразу после
последней стерилизации пробирки с просом встряхивают, охлаждают и
засевают взвесью конидий в среде Билай. В каждую пробирку вносят по 1 мл
взвеси конидий при концентрации их в среде 2 • 106 в 1 мл. Посев конидий
можно проводить путем соскабливания их с агаровой культуры.
Гриб выращивают при температуре 24-25° С в течение 1 мес. Полученный
посевной материал в дальнейшем хранят при комнатной температуре в сухом
месте до посева. Срок годности культуры 1 год.
111.3.4.2. ПОДГОТОВКА ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА P. VITALE НА ПШЕНЕ
Для получения посевного материала используют пшено высшего или первого
сорта (предварительно определяют его влажность). Цельные зерна пшена
помещают в кипящую водопроводную воду (соотношение воды и пшена 1:1 на
сухую массу) и варят при помешивании в течение 15-20 мин. Полуразваренное
зерно оставляют
112
на 15 - 20 мин в теплой упаковке, а затем переносят на пергаментную
бумагу для остывания и на фильтровальную бумагу для подсушивания. В
специальные флаконы емкостью 250 мл переносят по 10- 15 г из расчета на
сухую массу пшена. Флаконы закрывают ватными пробками, марлевыми и
пергаментными колпачками и стерилизуют текучим паром (температура 100° С)
в течение 30 мин, затем температуру повышают и стерилизуют при давлении 1
атм еще 30 мин. После стерилизации пшено охлаждают, встряхивают и
вторично стерилизуют в том же режиме через 20 ч.
Для засева готовой среды можно использовать взвесь конидий 1-2-месячной
культуры, выращенной на сусловом агаре, или суспензию конидий
стандартного посевного материала, для чего в матрас или во флакон
добавляют стерильную водопроводную воду из такого расчета, чтобы
полученная суспензия содержала (2 - 3) • 105 конидий в 1 мл. Для засева
среды берут 0,5 - 1 мл суспензии на флакон.
После засева конидий флакон закрывают ватной пробкой, встряхивают для
равномерного распределения культуры в питательном субстрате и помещают в
термостат на 7-10 сут (24-25° С) до получения хорошего равномерного роста
и спороношения. Во время роста культуру периодически встряхивают.
Выросшую культуру подвергают непрерывной вакуумной сушке при температуре
не выше 28° С в течение 48-72 ч до достижения постоянной массы. Убыль
влаги определяют ежесуточным взвешиванием. После высушивания горлышко
флакона с посевным материалом парафинируют и покрывают пергаментным
колпачком. К каждому флакону прилагается этикетка, на которой указывается
наименование штамма, номер паспорта и партии, дата выпуска, срок
годности. Приготовленный таким образом посевной материал хранят при
комнатной температуре и нормальной влажности. Срок годности посевного
материала - 1 год с момента посева конидий на субстрат.
Посевной материал P. vitale Pidopl. et Bilai (штамм 1312/140) имеет вид
крупинок зеленого цвета, свободно перемещающихся при встряхивании
флакона. Во флаконе содержится около 10-15 млрд. конидий. Всхожесть
конидий должна быть не ниже 80%. Ее определяют путем выращивания гриба в
колбах емкостью 0,75 л, содержащих 120 мл среды Билай, после 12-15 ч
ферментации на качалках при 240 об/мин. Всхожесть подсчитывают в счетной
камере и выражают в процентах.
В посевном материале должна отсутствовать посторонняя микрофлора. Чистоту
посевного материала проверяют засевом на бульон и агар Хоттингера или МПА
и МПБ с 0,5% глюкозы и инкубацией при температуре 37° С до 4 сут. Для
исключения загрязнения дрожжами или другими грибами его высевают на
сусловый агар или среду Чапека и инкубируют при температуре 25 и 37° С не
менее 5 сут.
Морфология, характерная для данного штамма: колонии на агаре Чапека с
сахарозой сначала белые, затем зелено-голубые, бархатистые, покрытые
желтоватыми мелкими каплями, складчатые, с довольно широким белым краем,
впоследствии приобретающие грязно-сероватый оттенок. Обратная сторона
колонии сначала соломенно-желтая, затем желто-коричневая. Агар
окрашивается в зеленоватый цвет.
Активность посевного материала определяют контрольной ферментацией по
регламенту. Для этой цели 2% флаконов из партии посевного материала
подвергают ферментации (после 43-46 ч ферментации в колбах емкостью 0,75
л, содержащих 200 мл среды, pH инокулю-ма составляет 6,8-7,5,
глюкозооксидазная активность отсутствует,
113
Схема ведения культуры Penicillium vitale- продуцента глюкозооксидазы и
каталазы [329]
каталазная активность достигает 35-50 ед./мл). При засеве культурой
ферментационной среды Билай из расчета 4-6% после 72 ч ферментации при
прочих оптимальных условиях культивирования, pH культуральной жидкости
