Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 47

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 279 >> Следующая

мм бидистиллированной воды. Для приготовления фиксатора берут одну часть
буфера (из расчета нужного для работы объема раствора), одну часть 0,1 н.
соляной кислоты, две части бидистиллированной воды, четыре части 2%-ного
раствора четырехокиси осмия и добавляют 0,015 г сахарозы на каждый
миллилитр фиксатора. Значение pH доводят до 7,4, используя при этом буфер
или 0,1 н. соляную кислоту.
Фиксацию методом J1 афта применяют при изучении тонкого строения
клеточных структур изолированных оболочек клеток, ядер, митохондрий,
различных эндоплазматических структур [215]. Отдельно готовят 1-2%-ный
раствор перманганата калия, который хранят в темной посуде с притертой
пробкой в холодильнике, и раствор буфера: в 100 мл бидистиллированной
воды растворяют 1,88 г натрийверонала и 1,15 г ацетата натрия. Сливают
равные части раствора перманганата калия и буфера, доводят pH фиксатора
до 7,2-7,6. Время фиксации препаратов от 15 мин до нескольких часов при
температуре около 0° С. При более высокой температуре препарат
разрушается вследствие сильного и быстрого окисления (рис. 51).
Фиксация перманганатом калия. Для фиксации клеток из культур грибов,
выращенных погруженным способом или на агаризованных средах, а потом
отцентрифугированных, применяют 1,5%-ный раствор перманганата калия.
Значение pH фиксатора зависит от объекта: виды Fusarium лучше фиксируются
при pH 7,4; Neurospora - 7,6; Puccinia - 6,5-7,2; дрожжи Rhodotorula и
Saccharomyces - 4,5. Время фиксации 0,5-1 ч при температуре 4° С.
После фиксации любым способом препараты должны быть отмыты от фиксатора.
Четырехокись осмия и перманганат калия отмывают нейтральным буфером,
дважды разбавленным дистиллированной водой с такой же концентрацией
натрия или сахарозы, которая использовалась при фиксации. В качестве
промывочных сред для других фиксаторов применяют растворы, в которых
фиксировались объекты без фиксатора или же какие-либо растворы,
содержащие NaCl в такой же концентрации, как в фиксирующем растворе.
Время отмывки около 5 мин, при температуре, равной температуре фиксации.
Многие
102
исследователи предпочитают промывать препарат в спирте, концентрация
которого равна начальной в ряду концентраций спиртов, используемых для
обезвоживания.
11.3.2.3. ВЫСУШИВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ
Препараты, подготовленные к электронно-микроскопическим исследованиям,
должны быть абсолютно сухими. После фиксации их подсушивают при комнатной
температуре или при 26-28° С в термостате, а затем обезвоживают в ряде
спиртов с возрастающей концентрацией вплоть до абсолютного спирта. Можно
пользоваться этиловым, метиловым спиртами, а также ацетоном. В каждом
конкретном случае подбирают оптимальные условия обработки материала.
11.3.2.4. НАПЫЛЕНИЕ ОБЪЕКТОВ
Для повышения контрастности препаратов их напыляют, т. е. покрывают
тонким слоем хрома, золота, платины, палладия, урана или других металлов,
подбирая напылитель в зависимости от объекта. При исследовании грибов,
как правило, применяют платину или
Рис. 52. Поверхность одноклеточной конидии Fusarium moniliforme (X 2000,
препарат приготовлен методом платино-углеродных реплик).
Рис. 53. Микроструктура верхнего слоя гифы Fusarium moniliforme (X 6200;
препарат приготовлен методом платино-углеродных реплик).
Рис. 54. Поверхность двухклеточной конидии Fusarium culmorum (X 3500;
препарат приготовлен методом платино-углеродных реплик).
палладий, которые наносят очень тонким слоем. При напылении золотом и
хромом получается крупнозернистое изображение, затрудняющее исследование
тонких структур, требующих больших увеличений. В настоящее время
наилучшим напылителем считают уран. При исследовании грибов в качестве
напылителей используют также
103
осмиевую кислоту, азотнокислый лантан, фосфорномолибденовую кислоту,
фосфорновольфрамовую кислоту, уксуснокислый уран и другие соли тяжелых
металлов. Напыление производят в специальных приборах (рис. 52-54).
11.3.2.5. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕЗОВ НА УЛЬТРАМИКРОТОМЕ
Для микротомирования препарат специально обрабатывают (для получения
блоков), обезвоживают, пропитывают и заливают метакрилатами (я-
бутилметакрилатом или я-метилметакрилатом), которые легко проникают в
различные ткани и клетки, хотя иногда искажают вид отдельных структур.
Метакрилаты ядовиты, поэтому с ними работают под вытяжкой; хранят на
холоду в темном месте. Для заливки пригодны лишь метакрилаты без примеси
гидрозинона (ингибитор) [64, 167].
Хорошие ультратонкие срезы получают при использовании блоков, твердость
которых соответствует твердости объекта. Твердость полимеров метакрилата
можно регулировать, добавляя к я-бутилме-такрилату я-метилметакрилат
(обычно в соотношении 4 : 1). Если готовят препараты тонких гиф,
соотношение я-бутил- и я-метилметакрила-тов составляет 9:1. Катализатором
полимеризации служит 2%-ный спиртовой раствор перекиси бензоила, который
хранят в темноте, а перед употреблением тщательно высушивают на
фильтровальной бумаге в эксикаторе или термостате при 37° С в течение 15-
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed