Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 44

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 279 >> Следующая

характерными спектрами поглощения, а зачастую и люминесценции.
Спектральные характеристики отражают те изменения структуры данной
молекулы, которые определяют их биологические функции. Основными1
приборами, применяемыми для люминесцентного спектрального анализа,
являются микро-спек.рофлюориметры и микрофлюориметры [196].
II.2.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МЕРТВЫХ КЛЕТОК
Для определения количества мертвых клеток 1 г сырого мицелия суспендируют
в 100 мл водопроводной воды и вносят по 15 мл суспензии в две пробирки.
Одну из них помещают на 10 мин или более в кипящую водяную баню до полной
гибели клеток. Объем жидкости в пробирке доводят водой до исходного.
Затем в обе пробирки вносят по 3 мл раствора примулина в концентрации 1
мг/мл из расчета 1 мл красителя на 5 мл суспензии мицелия и окрашивают в
течение 5 мин. Для удаления свободного красителя суспензии центрифугируют
при п = 6000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость осторожно
сливают, а осадок клеток мицелия, как убитых нагреванием, так и не
подвергавшихся кипячению, разводят 15 мл воды и флюориметри-руют на
флюориметре ФВ-1. В качестве источника возбуждения используют лампу СВД-
120А с фильтром УФС-6 (Я = 365 нм) и скрещенным фильтром ЗС-1.
На флюориметре определяют интенсивность свечения исследуемой взвеси с
неизвестным содержанием мертвых клеток (АТ) и интенсивность свечения
взвеси со 100%-ным содержанием мертвых клеток в
96
I мл, которое принимают равным 1. Далее вычисляют количество мертвых
клеток (М) в исследуемой взвеси как отношение интенсивностей свечения: -
щ,- • 100%. Время измерения одной пробы составляет 1-3 мин [67].
Экспресс-метод определения жизнеспособности конидий. Каплю суспензии
конидий наносят на чистые предметные стекла или стекла с глицерин-
желатиновым покрытием и окрашивают 0,005%-ным водным раствором
акридинового оранжевого в течение 3 мин. Живые конидии светятся ярким
зеленоватым цветом, мертвые - красным или оранжевым [192].
Метод люминесцентной микроскопии для выявления грибной инфекции в
растительных тканях подробно изложен в работах [253, 291].
11.3. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
11.3.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Электронная микроскопия основана на использовании потока электронов,
который под действием электромагнитного поля концентрируется или
рассеивается так же, как световые лучи при прохождении через систему
линз. Электроны, попадая на пластинку, покрытую веществом определенного
состава, вызывают ее свечение. Длина волны потока электронов в сотни раз
короче световых волн, что значительно увеличивает разрешающую способность
электронных микроскопов (25-60А). Это позволяет увеличивать объект в 100
000 - 500 000 раз и исследовать его на субклеточном и молекулярном
уровнях.
Техника электронной микроскопии и интерпретация данных требуют
определенных навыков и тщательного предварительного изучения объекта в
световом микроскопе.
11.3.2. ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Техника приготовления препаратов для электронного микроско-пирования
отличается от таковой для световой микроскопии [321, 352, 373, 428, 555,
823]. Для изучения строения поверхности клеток, их формы, структуры,
придатков обычно исследуют целые клетки; для исследования тонкого
внутреннего строения пользуются ультратонки-ми срезами, получаемыми на
ультрамикротоме.
Препараты готовят не на предметных стеклах, а на специальных пленках
(пленках-подложках) из коллодия, формвара (поливинил-формальдегида), угля
или кварца, толщина которых не должна превышать 200 А. Чаще всего
используют раствор коллодия в амилацетате. Для этого аптечный эфирный
раствор коллодия выливают тонким слоем в чашку Петри и высушивают в
вытяжном шкафу до образования застывшей прозрачной пленки. После этого
чашку с пленкой помещают на 1-2 сут в вакуум (10~4-10~5 мм рт. ст.) и
затем растворяют в амилацетате (18-24 ч). При исследовании грибов обычно
пользуются 0,5-2%-ными растворами коллодия, учитывая, что концентрация
раствора должна соответствовать величине объекта. Раствор готовят в
небольших количествах, так как он быстро портится. Для изготовления самой
пленки-подложки в чашку Петри наливают дистил-
4 2-66
97
лированную воду, затем пастеровской пипеткой наносят на ее поверхность
каплю раствора коллодия. Амилацетат испаряется, капля растекается по
поверхности и быстро застывает в виде тонкой пленки. Первая капля
непригодна для работы, так как загрязнена пылью, плавающей на поверхности
воды. Поэтому используют пленку от второй, третьей и т. д. капель. Пленку
осторожно вынимают из воды пинцетом с тонкими отшлифованными концами.
Для получения очень тонких прозрачных равномерной толщины пленок каплю
раствора амилацетата с коллодием наносят на поверхность выпуклого мениска
воды, налитой до краев в чашку Петри диаметром 20 см, или же пользуются
водой, насыщенной парами амилацетата. В воду, находящуюся в колбе,
доливают амилацетат, смесь энергично встряхивают и отстаивают в течение
суток. Потом наносят на поверхность такой воды каплю растворенного
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed