Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
клетчатка - в желтый или зеленый, ядра - в пурпурный.
91
Метод Кобеля. Применяют для окраски гаусторий ржавчинных, пероноспоровых
и других грибов. Живой или гербарный материал окрашивают в молочнокислом
растворе анилинового синего (0,1 г анилинового синего, 50 мл молочной
кислоты, 100 мл воды) с нагреванием или без него в течение 5 мин,
промывают в воде и нагревают в капле молочной кислоты для дифференциации.
Гифы и гаустории окрашиваются в синий цвет. Для окраски гиф мучнистой
росы используют 0,5%-ный раствор анилинового синего в 1%-ном водном
растворе хлористого натрия [191].
11.2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
11.2.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Метод люминесцентной микроскопии основан на том, что некоторые структуры
клетки, облученные световыми лучами сине-фиолетового участка спектра, а
также ультрафиолетовыми лучами определенной длины волны (до 360-365 нм),
начинают светиться. Это явление называют фотолюминесценцией или
собственно люминесценцией. Структуры большинства видов грибов не обладают
таким свойством, но приобретают его при окраске специальными веществами
флюоро-хромами (так называемая вторичная люминесценция). Основные
достоинства люминесцентной микроскопии заключаются в высокой
чувствительности, специфичности, четкости изображения, возможности
применения метода для живых и фиксированных клеток, в удобстве проведения
количественных исследований.
11.2.2. ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
11.2.2.1. ФЛЮОРОХРОМИРОВАНИЕ ЖИВЫХ ПРЕПАРАТОВ
Для прижизненного окрашивания культуру гриба выращивают на стекле в
тонком слое агаризованной или в капле жидкой питательной среды. Препарат
окрашивают слабым раствором флюорохрома (1: 100 000) и наблюдают в
микроскопе. Можно приготовить суспензию клеток гриба в пробирке с
красящим раствором и оттуда брать материал для исследования.
И.2.2.2. ФЛЮОРОХРОМИРОВАНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Для приготовления фиксированного препарата на стекло наносят каплю воды,
в которую помещают исследуемый материал (срезы или части гиф, плодовых
тел, конидий), и подсушивают ее на воздухе. Далее следует специальная
фиксация, обеспечивающая сродство к тому или иному красителю [9]. Обычно
применяют абсолютный спирт, 70%-ный этиловый или метиловый спирт,
жидкости Карнуа, Флемминга и др. Срок фиксации - от нескольких минут до 1
ч: для мицелия 30 мин - 1 ч, для конидий 10-30 мин, для прорастающих
конидий 5-20 мин. При употреблении формалина продолжительность фиксации
составляет 3-5 мин. После этого фиксатор высасывают пипеткой или
фильтровальной бумагой, а препарат промывают дистиллированной водой 5-6
раз, подсушивают на воздухе и вносят каплями рабочий раствор флюорохрома.
Время окраски зависит от объекта,
92
Таблица 1. Флюорохромы для общего окрашивания клетки
Флюорохром Концентра- ция Цвет люминесценции
Акридиновый оранжевый 1 : 100 000 От зеленого до оранжевого
Акридиновый желтый 1 : 100 000 Желтый
Аурамин О 1 : 100 000 "
Аурофосфин 1 :500 000 Светло-зеленый
Берберин-сульфат 1 : 100 000 Светло-желтый
Корифосфин О 1 : 100 000 Светло-зеленый
Нейтральный красный 1 : 200 000 От светло-розового до зеле-
новатого
Примулин О 1 : 100 000 Желтый
Родамин В 1 : 100 000 Светло-желтый
Тиофлавин 1 : 100 000 Светло-зеленый
Трипофлавин 1 : 500 000 "
Флюоресцеин 1 : 100 000 "
Таблица 2. Флюорохромы для дифференциальной окраски структур клетки
Флюорохромы Концен- трация Время обработки, мин Цвет
люминесценции
Дифференциация ядра и протоплазмы
Основные
Корифосфин О 1 1000 0,5-1 Желтый
Аурофосфин 1 1000 0,5-1 "
Фосфин ЗР 1 1000 0,5-1 "
Т рипофлавин 1 1000 1 Желто-зеленый
Эухризин 2gNX и ЗР 1 1000 1-2 Золотисто-желтый
Рэонин А 1 1000 1 Зеленый
Морин (спиртовой раствор) 1 1000 2 Темно-красный
Нейтральный красный 1 1000 5 От светло-розового до
Берберин-сульфат 1 : : 1000 0,5-0,1 зеленовато-желтого Светло-
желтый
Кислые
Водный экстракт чистотела - 1-2 Золотисто-желтый
Водный экстракт крово- - 1 Желтый
хлебки
Аминотерефталевая кисло- - 2-3 Синий
та (спиртовой раствор)
Дифференциация клеточных оболочек
Розовый красный 1 : 1000 2-5 Оранжево-желтый
Тиазоловый желтый 1 : 1000 1 Синеватый
93
Продолжение табл. 2
Флюорохромы Концен- трация Время обработки, Цвет люминесценции
мин
Дифференциация жиров
Основные
Нейтральный красный 1 :1000 1 Золотисто-желтый
Хлорофилл (спиртовой 1 : 1000 2-4 Огненно-красный
раствор) Магдала красный 1 :1000 1 Желтый
Фосфин 3 1 :1000 2 Желто-зеленый
Корифосфин О 1 : 1000 1 "
Примулиновый желтый 1 : 1000 2 Синий
Трипофлавин' 1 : 10000 10 Темно-красный
Кислые
Экстракт чистотела - 2-4 Бирюзово-голубой
Экстракт кровохлебки - 2 Желтый
Экстракт ревеня 2 Золотисто-желтый
устанавливается экспериментально в каждом случае и обычно длится от
нескольких секунд до нескольких минут.
Флюорохромирование следует проводить при строго определенных значениях
pH, в зависимости от выбранного красителя [174]. Например, при
употреблении раствора акридинового оранжевого с pH 2,5 клетки диффузно
