Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Необходимо помнить, что 1 мм3 в 4000, а 1 см3 - в 4 000 000 раз больше
объема одной призмы.
В лабораторной практике обычно пользуются камерами Тома, Нейбауера,
сеткой Предтеченского и т. д. В камере Тома и сетке Пред-теченского
очерченная на пластинке площадь равна 1 мм2. На каждой камере обозначены
числовые характеристики.
Количество конидий или отдельных клеток в 1 мм3 вычисляют по формуле Х -
аб • 4000, где а - количество клеток в определенном объеме камеры; б -
число сосчитанных квадратов. При пересчете на 1 см3 произведение аб
умножают на 4 000 000. Подсчет проводят в -каждом квадрате по диагонали.
Для очень разбавленных смесей за единицу поверхности принимают не один
квадрат, а всю камеру. Та-
80
ким образом подсчитывают также крупные конидии, делящиеся гифы и другие
объекты, для изучения которых пользуются малым увеличением микроскопа.
Для большей точности подсчитывают конидии не в одной, а в нескольких
каплях исследуемой взвеси. Полученные данные рекомендуется обработать
методом вариационной статистики [386].
11.1.4. ИЗУЧЕНИЕ ОБЪЕКТОВ В ЖИВОМ СОСТОЯНИИ
И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВРЕМЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
11.1.4.1. МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ
В живом состоянии обычно изучают объекты, которые надо идентифицировать
без дополнительной окраски, требующей фиксации [234, 291].
На хорошо вымытое и высушенное предметное стекло наносят каплю воды и
помещают в нее исследуемый материал. Препарат покрывают покровным стеклом
и исследуют сначала при малом, а затем при большом увеличении. При
изучении гифальных грибов, особенно строения их конидиеносного аппарата,
необходима предварительная специальная обработка препаратов [264, 526].
Если исследуют грибы, имеющие легко растворяющиеся структуры, или цепочки
спор, препараты готовят на смеси спирта, глицерина и воды (1:1:1). Для
обнаружения про-ростковых пор, изучения строения оболочки конидий и
других элементов конидиеносного аппарата проводят мацерацию объекта
[234]. Для выявления стадийности роста, типа прорастания, различных
закономерностей физиологии грибы культивируют в камерах Ранвье, кольцах
Ван-Тигема и т. д. [316].
Морфологические исследования можно проводить не только в жидкой среде, но
также в агаризованной по методу Пидопличко [353]. Предметные стекла
промывают несколько раз в хромовой смеси, сушат, складывают в пачки,
заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве. При посеве извлекают по
одному стеклу, дополнительно прокаливают его над пламенем газовой
горелки, быстро наносят раскаленной стерильной петлей небольшую каплю
расплавленной агаровой среды и дают ей слегка остыть. Тут же у горелки
наносят иглой посевной материал, стараясь, чтобы он попал в центр капли.
Покровное стекло, подготовленное таким же образом, как и предметное,
прокаливают над горелкой, чуть отводят от пламени, чтобы оно слегка
остыло, и накладывают на каплю среды с посевным материалом, находящуюся
на предметном стекле. Покровное стекло осторожно придавливают до тех пор,
пока агаровая среда не распределится равномерно сужающимся тонким слоем,
и располагают его под углом 10-15° к предметному стеклу. Покровное стекло
с трех сторон, за исключением поднятой, рекомендуется заливать парафином,
чтобы избежать загрязнения и высыхания. Предметное стекло с препаратом
кладут в чашку Петри так, чтобы та сторона, где предметное и покровное
стекла не соприкасаются, была направлена вверх, и помещают в термостат. В
зависимости от цели опыта наблюдения за посевным материалом ведут через
определенные промежутки времени. Прорастание спор требует особенно
тщательных наблюдений и поэтому в зависимости от вида гриба следует
начинать наблюдения через несколько часов (2-12) после посева. Препараты
вынимают из термостата, микроскопируют и быстро помещают обратно. Для
получения типичного спороношения у гифальных грибов
81
и изучения их развития в онтогенезе применяют метод микрокультуры [59,
94] (см. раздел IV.4.6.)
Нефиксированные препараты, особенно грибы с бесцветными органами
спороношения, перед исследованием окрашивают. Витальное окрашивание
представляет собой сложную реакцию, с помощью которой можно воспроизвести
модель некоторых процессов клеточного обмена, и не вызывает заметных
нарушений жизнедеятельности объек-
Рис. 46. Метахроматиновые включения в гифах фузария, окрашенные
нейтральной красной.
тов исследования. Основной краской гранулярного типа, применяемой для
этих целей, является нейтральная красная [рис. 46]. При подкрашивании
клетки 0,02%-ным раствором нейтральной красной вакуоли приобретают
розовую окраску, а гранулы метахроматина - ярко-красную [316, 358].
При исследовании объектов методом "раздавленной капли" можно измерить pH
в живом препарате с помощью специальной микрошкалы, устроенной по типу
окулярмикрометра. Для получения шкалы используется индикатор метиловый
красный. Индикаторный листок окрашивают до желаемой густоты, нагревая его
в концентрированном растворе индикатора, разрезают на полоски 1-2 мм в
