Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
которых определяет-
468
ся особенностями организмов, интенсивностью их высушивания,
продолжительностью хранения и пр. Важное значение при восстановлении
культур имеет скорость регидратации. Ампулы с лиофилизированной культурой
открывают следующим образом. Снаружи ампулу дезинфицируют спиртом или
другим способом, затем надрезают ее специальной пилкой. Стерильной
пастеровской пипеткой в препарат вносят несколько капель стерильной воды
или питательной среды, в которой будет развиваться гриб. Полученной
суспензией засевают агаровую среду. Выведение живых клеток из состояния
анабиоза протекает успешней, если посев производят не сразу, а суспензию
или споры выдерживают некоторое время во влажной атмосфере. При
определении жизнеспособности клеток необходимо соблюдать условия
восстановления лиофилизированных культур.
ХХ.2.4. КРИОГЕННЫЙ МЕТОД ХРАНЕНИЯ
Метод хранения коллекционных культур при температурах ниже 0° С применяют
давно и к настоящему времени накопилось много сведений о влиянии низких
температур на микроорганизмы. Большинство из них легко переносят
замораживание и длительное время сохраняют жизнеспособность.
Замораживанию с помощью жидкого азота подвергают культуры грибов на
питательных средах, воздушносухие споры и суспензии спор.
0,5-1,0 мл суспензии клеток или конидий концентрацией (1,69- 5,88) - 10б
клеток/мл вносят в стерильную ампулу или пробирку. При необходимости
замораживания большого объема суспензий их наливают во флаконы с таким
расчетом, чтобы в процессе замораживания можно было равномерно
распределить суспензию по стенке флакона, так чтобы толщина замороженного
слоя не превышала 1 см. Затем ампулы или пробирки медленно охлаждают до -
35° С (со скоростью 1°/мин) с помощью специальной аппаратуры [593] или
пробирки с суспензией диаметром 1 см помещают во вторую, более широкую
диаметром 4,5 см; пространство между стенками широкой и узкой пробирок
заполняют теплоизоляционным пластиком - мипорой [392]. Скорость
охлаждения определяют термопарой. После достижения образцами -35° С
охлаждение ведется быстрее. Пробирки или ампулы переводят в газовую фазу
рефрижератора (от -160 до -196° С) или погружают в сосуд Дюара с жидким
кислородом (-183° С). Пробирки и ампулы запаивают в холодильной камере.
Культуры хранят при температуре от -150 до- 196° С в специальных камерах.
При восстановлении культур их подвергают быстрому оттаиванию. Для этого
ампулы или пробирки с замороженными культурами погружают в водяную баню
при температуре 38° С и встряхивают. После оттаивания культуры
ресуспендируют в холодной воде (2-3° С) [593, 600, 629, 630]. Суспензию
высевают на питательную среду.
Испытан метод хранения грибов в жидком азоте с использованием
полиацетатной пленки вместо стеклянных ампул, флаконов или пробирок.
Споры Aspergillus, Botrytis, Chaetomium, Cladosporium, Hel-minthosporium,
Trichoderma и представителей других родов при хранении в полиацетатных
пакетиках оставались жизнеспособными 7 и более месяцев [819]*
Устойчивость культур грибов к замораживанию, их выживаемость н
последующее восстановление зависят от ряда условий.
Внезапное падение температуры до 0° С или ниже губительно влияет на живые
клетки вследствие температурного шока, избежать ко-
469
торый можно путем постепенного охлаждения в том же температурном
интервале. Постепенное охлаждение обеспечивает так называемую
температурную адаптацию. Методы криогенного хранения культур поэтому и
основаны на медленном (около 1°/мин) охлаждении до -35° С и последующем
быстром охлаждении до более низких температур. Культуры грибов в
замороженном состоянии хранят при разной температуре, но лучшие
результаты получены при температуре ниже - 130° С [629, 641, 670, 819].
Колебание температуры при хранении недопустимо, а повторное замораживание
и оттаивание губительны для организмов.
Некоторые среды понижают чувствительность клеток к действию холода.
Обычно для этих целей применяют глицерин, количество которого должно
достичь 15-20% объема суспензии. Присутствие глицерина обеспечивает не
только обезвоживание живых клеток при замораживании, но и создает
условия, наиболее благоприятные для обратной отдачи воды клеткам при
оттаивании. Суспензионная среда должна содержать минимальные количества
электролита. В качестве защитных сред кроме глицерина используют
диметилсульфоксил (10- 15%), сахарозу или лактозу (10-30%), желатозу -
двукратно авто-клавированный желатин (5-10%), пептон (5%), обезжиренное
молоко (30-50%), сыворотку крови, инактивированную в течение 1 ч при 56°
С (30-50%). Хорошие результаты, например, получены при хранении
патогенных штаммов в 10-15%-ном растворе дисульфо-ксида.
Ресуспендированные конидии вызывали как локальную, так и общую инфекцию
растений, в то время как жизнеспособность и патогенность конидий,
замороженных в 10%-ном растворе глицерола и ресуспендированных в воде,
значительно снижались и лишь у 5 из 35 зараженных растений сорго
