Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
несколько частичек силикагеля и помещают в термостат. Культуры,
заготовленные для длительного хранения, парафинируют и хранят при 5° С в
закупоренных пластмассовых боксах. Этим методом хранилось более 700
штаммов Neurospora crassa. Обезжиренное молоко в качестве суспензионной
среды оказалось более эффективным, чем дистиллированная вода - 90%
культур оставались живыми при хранении в течение 1-6 лет.
Нежизнеспособными оказались штаммы, слабо или совсем не образующие
конидий [729]. Метод Перкинса был использован для длительного хранения
культур 33 видов бактерий и 22 видов грибов. При комнатной температуре
через год и более выживаемость грибов составляла 77, через 3-4 г - 33%.
Жизнеспособность увеличивалась в 2-3 раза при хранении культур при
температуре 4° С [815].
ХХ.2.3.2. ЛИОФИЛИЗАЦИЯ
Лиофилизация, или высушивание из замороженного состояния под вакуумом,
заключается в том, что вода при пониженном давлении удаляется из
высушиваемого материала путем превращения льда непосредственно в пар,
минуя жидкое состояние.
Готовят густую взвесь спор в нормальной лошадиной сыворотке без
консерванта или в жидкости, состоящей из 10% сахарозы и 1% желатина.
Суспензию разливают пастеровской пипеткой по 0,2 мл в стеклянные ампулы с
перетяжкой. Ампулы замораживают, погружая на 20 мин в смесь твердой
углекислоты с этиловым спиртом от -60 до -68° С, и помещают в вакуум-
аппарат с остаточным давлением около 100 мм рт. ст. Длительность сушки
зависит от мощности вакуум-насоса и количества высушиваемого материала
[241]. Достаточно эффективно высушивание в течение 1-1,5 ч в вакууме под
давлением
467
200-500 мм рт. ст. Остаточная влажность высушенного (материала не должна
превышать 5%. Лиофилизации в большинстве случаев подвергают густые
суспензии спор, для получения которых микроорганизмы, в том числе и
грибы, следует выращивать в оптимальных для них условиях, но на средах,
которые не вызывают пышного роста мицелия. У обильно спороносящих культур
выживаемость выше [616]. Лучшие результаты получают при лиофилизации
микроорганизмов в логарифмической фазе роста [582, 721, 733].
Особо важное значение для лиофилизации имеют среды. Они представлены
тремя основными группами: а) коллоидные животного, растительного и
минерального происхождения (сыворотка крови, плазма, снятое молоко, агар-
агар, гель гидрата окиси алюминия, желатин и др.); б) содержащие углеводы
(обычно 1-10%-ные растворы сахарозы, лактозы, глюкозы) и продукты
гидролиза белков, такие, как пептон и аминокислоты; в) сложные, в состав
которых входят вещества, образующие как коллоидные, так и истинные
растворы [65]. Для лиофилизации грибов используют сыворотку крови, снятое
молоко, растворы сахаров и др. При изучении режима лиофилизации спор Asp.
niger было отмечено, что при добавлении в среду высушивания 20% сахарозы
или глюкозы выживаемость повышается до 8 Г-85% независимо от режима
замораживания, температуры и скорости лиофилизации [611]. Добавление в
среду высушивания сахарозы или глюкозы не влияет на температуру хранения
и остаточную влажность препарата.
Замораживание высушиваемого объекта должно быть полным. Суспензию спор
быстро замораживают в высоком вакууме (10~3 - -10"4 мм рт. ст.) или при
атмосферном давлении с помощью сухого льда, жидкого воздуха, жидкого
кислорода, охлаждающих смесей. При применении охлаждающих смесей процесс
происходит медленнее, чем в вакууме. В вакууме можно осуществлять
замораживание со скоростью от нескольких градусов в секунду и нескольких
градусов в минуту до сотен градусов в секунду (сверхбыстрое
замораживание) [565]. Обычно замораживание грибов при лиофилизации
проводят при температурах от -45 до -68° С [210, 241].
Выживаемость лиофилизированных культур зависит от режима лиофилизации, т.
е. от скорости и условий замораживания и высушивания. Влияние различной
температуры замораживания и высушивания изучено на примере лиофилизации
спор Asp. niger [611]. В первом случае споры замораживали при -10° С и
высушивали при минусовой температуре; во втором- замораживали при -35 и -
65° С, а высушивали при комнатной температуре; в третьем - культуру
охлаждали самозамораживанием при центрифугировании. При первых двух
режимах сохранялось 10-70% жизнеспособных спор, а при последнем - до 47-
87%. Как правило, после окончания процесса лиофилизации следует
установить жизнеспособность высушенных культур.
Остаточная влажность оказывает большое влияние на выживаемость и
сохранение свойств лиофилизированных культур. Для грибов остаточная
влажность не должна превышать 4-5%.
Обычно лиофилизированные культуры хранят при комнатной температуре. Между
температурой хранения лиофилизированных микроорганизмов и скоростью
отмирания существует прямая зависимость [65]. Опыт показал, что лучше
сохранять культуру после лиофилизации при пониженной температуре (от 0 до
-10° С) [65, 611] в темноте [616]. Жизнеспособность лиофилизированных
культур зависит от методов выведения их из состояния анабиоза, выбор
