Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
иногда - синтетические агаризо-ванные среды с добавкой специфических
экстрактов, соков, отваров. Для хранения большинства видов грибов
разработан ряд стандартных питательных сред. Лишь некоторые виды
нуждаются в специфических средах, которые обычно состоят из естественного
субстрата или синтетической среды с добавкой вытяжки, сока, экстракта или
отвара тех субстратов, из которых гриб выделен. Вытяжки (настои) готовят
на холоду, без кипячения, иногда с легким подогревом. Как правило,
настаивают 100-150 г субстрата в 1 л воды в течение от нескольких часов
до суток. Настой сливают, фильтруют и стерилизуют. Отвары готовят
кипячением определенной навески субстрата в 1 л воды в течение часа
(например, гороха или бобов - 100 г, кукурузной муки - 500, картофеля -
250-300, овсяной муки - 50-100 г). Для приготовления отваров из сухих
субстратов берут не более 50 г субстрата на 1 л. Во всех случаях после
варки объем воды доводят до исходного. Затем отвар фильтруют, при
необходимости осаждают или подкисляют, разливают в микробиологическую
посуду и стерилизуют. Для приготовления агаризованных сред добавляют к
фильтратам 1,5-3% агара. Наиболее часто для хранения применяют сусло-агар
или другие агаризованные среды. Приготовленные субстраты после
стерилизации проверяют на стерильность. Для этого пробирки, флаконы или
ампулы с субстратом заливают питательной средой и выдерживают в
термостате при 28° С неделю, а затем уже всю партию высевают на хранение.
Для обеспечения организма разнообразными питательными веществами
некоторые исследователи рекомендуют при пересевах смену субстратов, в
частности синтетических растительными, или
462
добавление к синтетическим средам органических субстратов (кусочков
стеблей, коры и др.).
Температура имеет также большое значение для поддержания стабильности
культуры при хранении. Частые пересевы при некоторых методах хранения,
как правило, связаны с пересыханием культур. Обычно высушенные культуры в
запаянных ампулах хранят при комнатной температуре (18-20° С).
Пересеянные на твердые субстраты культуры тоже можно хранить при
комнатной температуре, но оптимальной для хранения культур между
пересевами считается температура 4-5° С.
Генетическая однородность материала, который закладывают на хранение,
играет существенное значение для поддержания стабильности культуры.
Гетерогенность чаще проявляется при выращивании культур из спор, реже -
из вегетативного мицелия. Стабильность при хранении значительно выше у
односпоровых культур. Отмечено, что утрата способности образовывать
склероции некоторыми пенициллами может быть ингибирована, если культуры
для хранения были выращены из одного склероция.
При пересевах обильно спороносящих культур, в частности при периодических
пересевах, переносить на среду следует минимальное количество спор
(конидий). При пересеве неспорообразующих форм кусочки мицелия нужно
брать из краевой зоны колонии, так как, если мицелий берется из середины
колонии, где накапливаются продукты обмена, изменчивость культур
повышается.
Для предупреждения гибели культур рекомендуется хранить их одновременно
несколькими способами, не менее чем в двух коллекциях и периодически
пересевать на свежие питательные среды. Независимо от способа хранения
необходимо вести микроскопический контроль за чистотой культуры, а в
случае хранения продуцентов биологически активных веществ - биохимический
контроль активности.
ХХ.2. МЕТОДЫ ХРАНЕНИЯ КУЛЬТУР ГРИБОВ
ХХ.2.1. ХРАНЕНИЕ НА АГАРИЗОВАННЫХ СРЕДАХ
ХХ.2.1.1. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПЕРЕСЕВЫ
Метод периодических пересевов на свежие питательные среды является
классическим и довольно распространенным. Положительными сторонами этого
метода являются постоянная доступность культур для работы и возможность
непосредственного контроля за их чистотой.
В пробирки заливают агаризованную среду, оптимальную для хранения данной
культуры, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин и при застывании слегка
скашивают. Высота столбика среды 5-6 см. В большинстве случаев не следует
употреблять свежеприготовленные среды, содержащие конденсационную воду.
Их следует слегка подсушить при комнатной температуре в течение 10-12
дней. Пересев культуры гриба производят путем переноса инокулюма из
жидкой среды или кусочков воздушного и субстратного мицелия или спор
(конидий, склероциев) из плотной среды. Затем культуры выращивают при
оптимальной для их роста температуре до появления спороношений. В течение
первых дней желательно вести наблюдение за ростом, так как в это время
легче обнаружить загрязнение. Выращенные культуры закрывают колпачками из
фильтровальной или другой влагопрони-
463
цаемой бумаги. Л. Рихардсон [754^1 предлагает закрывать пробирки с
чистыми культурами металлическими колпачками, покрытыми в промежутке
между стеклом и металлом пленкой "Parafilm" или "Saran Wrap". Таким
образом, культуры защищены не только от пересыхания, но и от загрязнения
другими грибами и клещами и могут храниться в течение 6 лет. Оптимальная
